短暂脑缺血诱导大鼠海马PKC-ε膜转位及HSP70表达

作者：徐进步作者单位：徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室，江苏徐州221002  【摘要】  目的 探讨蛋白激酶C-ε(protein kinase C, PKC-ε)和热休克蛋白 70(heat shock protein, HSP70)在脑缺血耐受形成过程中的作用。方法 将80只大鼠分为短暂脑缺血组和假手术组（n=40）,每大组根据取材时间又分为缺血后1 h、6 h、1 d、2 d、4 d 5个亚组（n=8）。应用大脑中动脉阻闭（middle cerebral artery occlusion, MCAO）方法和免疫印迹（western blot）技术观察大鼠短暂脑缺血20 min后海马神经细胞不同时间点PKC-ε膜转位及HSP70表达的变化。结果 假手术组各时间点的PKC-ε与HSP70无明显变化。在短暂脑缺血组，缺血后1 h海马神经细胞胞质PKC-ε的含量开始下降，至1天达最低点，持续到4天；而胞膜PKC-ε的变化趋势相反，含量于6 h显著增高，1天达到高峰，持续到4天；短暂缺血1 h后HSP70的表达无明显增加，6 h增多明显，1天达最高，持续至4天均处于较高水平。结论 短暂脑缺血诱导海马神经细胞PKC-ε膜转位和HSP70表达增加,可能是短暂脑缺血诱导缺血耐受的机制。 【关键词】  脑缺血 蛋白激酶    Transient ischemia induced membrane translocation of PKC-ε and expression    of  HSP70 in rat hippocampus    XU Jinbu1, XU Pengcheng1*, FENG Haorong1, WU Yongping2    (1. Jiangsu Province Key Laboratory of Anesthesiology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002,China;    2. Department of Pathology, Xuzhou Medical College)    Abstract： Objective  To investigate the roles of PKC-ε and HSP70 in the formation of brain ischemic tolerance. Methods  Middle cerebral artery occlusion (MCAO) model and Western blot analysis were used to observe the membrane translocation of PKC-ε and the changes in HSP70 expression in the hippocampal neurons at different time points (1 h,  6 h, 1 d, 2 d and 4 d after a 20 min transient cerebral ischemia). The results were compared with those of the sham-operation group. Results  No significant changes in PKC-ε and HSP70 were found in the sham-operation group.  In the transient cerebral ischemic group, cytoplasm PKC-ε began to decrease 1 h after treatment, reached its lowest level on 1 d and remained at such a level until 4 d; while the membrane PKC-ε tended to vary the opposite way: i.e. the membrane PKC-ε increased notably 6 h after transient ischemia, peaked on 1 d and remained high until 4 d. The expression of HSP70 began to increase obviously 1 h after transient ischemia, increased markedly at 6 h, peaked on 1 d and remained high until 4 d. Conclusion   Transient ischemia induces membrane translocation of PKC-ε and increases the expression of HSP70, which may be the genetic mechanism of ischemic tolerance induced by transient ischemia.    Key words:  cerebral ischemia; protein kinase C-ε; heat shock proteins 70；ischemic tolerance    缺血预处理可以提高组织和器官对致死性缺血损伤的抵御能力。短暂缺血是预处理的手段，它可以调动体内一系列内源性保护机制，从而实现对后来缺血的耐受。这种现象首先在犬心肌缺血模型中发现［1］，1990年证实大脑同样存在着缺血预处理的脑保护作用［2］。目前缺血预处理脑保护机制仍不完全清楚。有实验报道，心肌缺血预处理后蛋白激酶C-ε(protein kinase C,PKC-ε)活性适度增加并诱导对心肌缺血的抵抗力增加［3］；热休克蛋白70(heat shock protein,HSP70)可对脑缺血发挥保护作用［4］；但短暂脑缺血后PKC-ε和HSP70变化如何有待进一步观察证实。因此，本实验利用大鼠大脑中动脉阻闭 (middle cerebral artery occlusion,MCAO)方法进行短暂脑缺血，观察缺血后不同时间点PKC-ε的膜转位和 HSP70表达的变化，为进一步探讨脑缺血预处理的机制提供依据。

 1  材料和方法

    1.1  实验动物及试剂  雄性SD大鼠80只，体重250～300 g，由徐州医学院实验动物中心提供，生产许可证号：SYXK(苏)2003-003，使用证SYXK(苏)2002-0038。PKC-ε一抗（兔抗大鼠1∶800）、碱性磷酸酶标记的二抗(羊抗兔、马抗小鼠IgG，1∶500)均购自美国Santa cruz公司。HSP70一抗(小鼠抗大鼠，1∶250)购自武汉博士德生物工程有限公司。免疫印迹相关试剂购自碧云天生物技术研究所。

    1.2  大鼠短暂脑缺血模型的制备  采用MCAO法对大鼠进行短暂脑缺血处理。动物饲养及手术室温度控制在25℃左右,术前12 h禁食不禁水。将大鼠以35 mg/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉,仰卧固定于手术台上,取颈正中切口,暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,结扎颈外动脉和颈总动脉近心端,于颈内动脉远心端备线,在颈总动脉近分叉处剪一约0.2 mm 的“V”形切口,将预先经多聚赖氨酸及肝素处理过的直径为0.24 mm的尼龙渔线经该切口顺颈总动脉插入颈内动脉(18±1) mm,感到有轻微阻力时停止,使大脑中动脉起始部阻塞。扎紧备线并固定栓线,缝合皮肤切口。缺血20 min后将线栓拔出约10 mm,恢复再灌注。

    1.3  动物分组及取材  SD大鼠随机分为短暂脑缺血组及假手术组(n=40), 每大组根据取材时间又分为缺血后1 h、6 h、1 d、2 d、4 d， 5个亚组（n=8）。假手术组仅置入线栓20 min，不阻闭大脑中动脉。在各取材时间点，大鼠用乙醚再次麻醉，断头取脑，冰面上迅速分离右侧海马，液氮冷冻后转-80℃冰箱保存。

    1.4  胞溶蛋白和胞膜蛋白组分的分离  取出冻存的海马组织，按10 ml/g加入样品匀浆液A(mmol/L：Tris-Cl 50、 pH 7.5、 EDTA 2、EGTA 2、 DTT 2、Sodium pyrophosphate 5、 KF 50、Okadaic acid 5×10-5; leupeptin、aprotinin、 pepstatin A、chymostatin各5 g/L) 后，手动匀浆，超声波破碎。然后于4℃、30 000 g离心30 min ,取上清液作为胞溶蛋白组分(cytosolic)。沉淀部分加入匀浆液B (BufferA+0.5% NP-40,用量与匀浆液A相同)后，再次匀浆、超声破碎，4℃，30 000 g离心30 min,取上清液作为胞膜蛋白组分(particulate) 。胞溶蛋白和胞膜蛋白组分分别用lowry法进行定量检测。

    1.5  Western blot法测定脑组织的PKC-ε及HSP70表达  取上述胞溶蛋白和胞膜蛋白组分，煮沸变性。制备8%（用于PKC-ε测定）和10%（用于HSP70测定）的SDS-PAGE凝胶,加样电泳,待溴酚蓝电泳至分离胶底部时结束电泳。采用湿转法转膜,将醋酸纤维素膜(NC)浸入封闭液中,室温封闭4 h,将NC膜分别加入稀释的PKC-ε抗体及HSP70抗体, 4℃过夜, TBST清洗3次,每次10 min；放入稀释好的碱性磷酸酶标记的二抗室温2 h。NBT-BCIP显色试剂盒显色。所得条带经扫描照片，以Adobe photoshop 7.0软件进行灰度值分析，所得数值与假手术组1 h时间点数值相比得出相对值。

    1.6  统计学处理  数据均以±s表示，SPSS 13.0统计软件进行数据处理，选用单因素方差分析（ANOVA）,组间选用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  PKC-ε表达

    2.1.1  海马神经细胞膜PKC-ε表达的变化  短暂脑缺血后1 h海马神经细胞膜PKC-ε表达与假手术组比较无明显差异（P>0.05）。缺血后6 h PKC-ε在细胞膜的表达明显增加，2天时达到高峰，并延续至4天，分别是假手术各相对时间点亚组的159%、203%、210%和200%（图1）。

    图1  海马神经细胞膜PKC-ε表达的相对值变化

    与相对应时点的假手术组比较：*P<0.05；与短暂脑缺血1 h比较：#P<0.05；与短暂脑缺血6 h比较：△P<0.05

 2.1.2  海马神经细胞质PKC-ε表达的变化  假手术组各亚组之间海马神经细胞质中PKC-ε的表达无明显差异（P>0.05）。短暂脑缺血后6 h时PKC-ε的表达比对应的假手术组和短暂脑缺血1 h组明显下降(P<0.05)。短暂脑缺血1天组PKC-ε表达比6 h组进一步下降，直至缺血后4天均维持较低水平(图2)。

    图2  海马神经细胞质PKC-ε表达的相对值变化

    与相对应时点的假手术组比较:*P<0.05；与短暂脑缺血1 h比较:#P<0.05；与短暂脑缺血6 h比较:△P<0.05

    2.2  短暂脑缺血后PKC-ε在海马神经细胞膜和胞质之间的变化  短暂脑缺血后PKC-ε向膜转位明显增加。缺血后6 h PKC-ε在膜的表达逐渐增多，2天时达到高峰，并延续至4天；而胞质中PKC-ε的表达则相反（图3）。短暂脑缺血6 h组海马神经细胞PKC-ε表达的膜/质值比缺血1 h组显著增高(P<0.05)，随着时间延长这种比值不断加大。短暂脑缺血1 d 、2 d、4 d各组与缺血6 h组相比差异也有显著性（P<0.05），见表1。表1  短暂脑缺血后海马神经细胞膜与细胞质PKC-ε的比值(与短暂脑缺血1 h组比较：*P<0.05；与短暂脑缺血6 h组比较：#P<0.05

    2.3  短暂脑缺血后HSP70的变化  短暂脑缺血后海马神经细胞HSP70表达明显增加。以假手术1 h组的表达为标准，短暂脑缺血1 h组的表达略有升高，但无统计学意义；而缺血6 h、1 d、2 d和4 d组HSP70的表达较缺血1 h组有明显增加，其中1 d组HSP70为表达高峰，并且至缺血后4天也维持较高水平（图4）。图4  短暂脑缺血后海马神经细胞HSP70 表达的相对值变化

    3  讨  论

    本实验结果显示，短暂脑缺血可以诱导PKC-ε的膜转位增加。PKC是由多种同工酶组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，是一类典型的细胞内信号分子。短暂脑缺血是有害的刺激，能引起机体的应激反应，同样也会引起信号转导系统（包括PKC信号通路）的激活。短暂脑缺血诱导PKC-ε的膜转位增加的原因可能是：短暂脑缺血后脑组织ATP水解，释放腺苷，细胞外液中腺苷的含量增加，通过腺苷A1受体，激活磷酸酯酶C(PLC)，进而激活PKC。短暂脑缺血还可以使细胞内Ca2+增加，胞质内Ca2+浓度的上升使PKC从胞质移位到细胞膜而被激活。生理状态下细胞中PKC主要存在于胞质中，当受到缺血等刺激时，通过磷脂酶A2和磷脂酶C-二酰基甘油途径(DAG), 激活PKC，使其从胞质中向细胞膜移位，即膜转位［5］。膜转位增加表明PKC被激活。PKC的激活是机体调动或调整内源性保护机制的途径。Raval等［6］在离体培养海马脑片中使用PKC-ε的抑制剂可以阻断氧糖剥离模拟的缺血预处理，使用特异性药物激活PKC-ε又可以模拟缺血预处理导致的缺血耐受。Wang等［7］也报道在神经元和混合培养的神经元/星形胶质细胞氧糖剥离之前使用PKC-ε的激活肽才能产生缺血耐受作用。Baines等［8］在小鼠心脏的研究结果提示，PKC-ε通过激活细胞线粒体上的ERK起到了保护线粒体功能的作用。Ohnuma等 ［9］在离体兔心脏的研究发现，心肌细胞线粒体K(ATP)通道开放是PKC-ε激活的下游机制，因此可以认为PKC-ε的保护作用可能与开放ATP通道有关。

    热休克基因也会对缺血刺激产生反应。短暂脑缺血引起的一系列应激反应，能使HSP70在脑内的表达和分布发生改变，且表达的强度在一定程度上既反映神经细胞损伤程度又反映了机体的抵抗缺血损伤的机制［10］。本实验观察到，在假手术组各亚组之间，HSP70的表达无显著差异。短暂脑缺血6 h组HSP70的表达就有所增多，随着时间的延长，增加愈加显著，并维持在较高水平。HSP70可以发挥“分子伴侣”作用，维持蛋白质的自身稳定，阻止缺血引起的蛋白变性。另外，HSP70还可以提高细胞对应激原的耐受性和抗免疫作用等（如减少由IL-1 诱导的C3 补体产生,并增加IL-6 的生成），从而发挥细胞保护作用［10］。

  短暂脑缺血可以诱导大鼠海马PKC-ε膜转位及HSP70表达。二者在信息转导上是否存在着相互调控或影响，目前尚不十分明确。Wang 等［11］研究报道，缺血预处理后的肺泡上皮组织降钙素基因相关肽（CGRP）可通过激活PKC-ε上调HSP70的表达，增加细胞对后续缺血/缺氧的存活耐受能力。提示PKC-ε可能是HSP70的上游信使。

    总之，短暂缺血诱导的预处理脑保护/耐受的过程相当复杂并有许多信号系统的参与，阐明其机制仍需进行更加广泛和深入的研究。

【参考文献】  ［1］ Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium ［J］. Circulation,1986,74(5):1124-1136.

［2］ Kitagawa K, Matsumoto M, Tagaya M, et al. ‘Ischemic tolerance’ phenomenon found in the brain ［J］. Brain Res,1990,528(1):21-24.

［3］ Churchill RN, Mochly-Rosen D. The roles of PKC delta and epsilon isoenzymes in the regulation of myocardial ischaemia/reperfusion injury ［J］. Biochem Soc Trans,2007,35(Pt 5):1040-1042.

［4］ 赵建华，王 岚，陈小武，等. 脑缺血预处理及HSP70表达对大鼠脑梗死的保护作用［J］.中风与神经疾病杂志，2006,23(2):187-189.

［5］ 陈主初.病理生理学［M］.北京：人民卫生出版社，2005:39.

［6］ Raval AP, Dave KR, Mochly-Rosen D, et al. Epsilon PKC is required for the induction of tolerance by ischemic and NMDA-mediated preconditioning in the organotypic hippocampal slice ［J］. J Neurosci,2003,23(2):384-391.

［7］ Wang J, Bright R, Mochly-Rosen D, et al. Cell-specific role for epsilon- and betal-protein kinase C isozymes in protecting cortical neurons and astrocytes from ischemia-like injury ［J］. Neuropharmacology, 2004, 47(1): 136-145.

［8］ Baines CP, Zhang J, Wang GW, et al. Mitochondrial PKC epsilon and MAPK form signaling modules in the murine heart: enhanced mitochondrial PKC epsilon-MAPK interactions and differential MAPK activation in PKC epsilon-induced cardioprotection ［J］. Circ Res,2002,90(4):390-397.

［9］ Ohnuma Y, Miura T, Miki T, et al. Opening of mitochondrial K (ATP) channel occurs downstream of PKC-epsilon activation in the mechanism of preconditioning ［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002,283(1):H440-H447.

［10］ 朱子龙,王世民.热休克蛋白70与脑缺血［J］.天津医科大学学报，2004,10(增刊):121-123.

［11］ Wang W, Jia L, Wang T, et al. Endogenous calcitonin gene-related peptide protects human alveolar epithelial cells through protein kinase cepsilon and heat shock protein ［J］. J Biol Chem,2005,280(21):20325-20330.