硫氢化钠后处理对培养心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

作者：汪莉作者单位：江苏省麻醉医学研究所，徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室，江苏徐州221002 【关键词】  硫化氢 后处理 心肌细胞培养 缺氧 复氧损伤 大鼠    The protective effects of NaHS postconditioning against hypoxia/reoxygenation    injury in cultured rat myocardial cells    WANG Li, JI Yong, XU Gang, ZENG Yinming*    (Jiangsu Key Laboratory of Anesthesiology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)    Abstract： Objective  To explore the protective effects of H2S donor-NaSH postconditioning on the primary-cultured neonatal rat myocardial cells exposed to hypoxia/reoxygenation （H/R） injury.  Methods  Primary- cultured myocardial cells from neonatal rats were randomly divided into 4 groups: control group（normal）, hypoxia/reoxygenation group（H/R）, hypoxia postconditioning group（HPC） and NaHS postconditioning group（H/R+NaHS）. A model of H/R injury was reproduced by exposing the cell culture to 2 h of hypoxia and 2 h of reoxygenation. The percentage of surval cells, the activities of lactate dehdrogenase (LDH) and superoxide dismutase (SOD), and the content of malondialdehyde (MDA) were determined at the points of pre-hypoxia, hypoxia for 2 h and reoxygenation for 0.5 h ,1 h and 2 h.  Results  No obvious changes were detected in H/R group, HPC group and H/R+ NaHS group until hypoxia 2 h. After standard hypoxia postconditioning and NaHS postconditioning respectively, the surval rate was higher in the HPC and H/R+ NaHS groups than in the H/R group ［(70.5±2.2）% and （66.2±2.5）% vs （61.3±1.8）%, P﹤0.05］. Meanwhile the activities of LDH in HPC and H/R+ NaHS groups were obviously lower than that in H/R group ［(36.2±1.3） U·L-1 and （39.5±1.5） U·L-1 vs （44.6±1.7） U·L-1， P﹤0.05］. The contents of MDA in HPC and H/R+ NaHS groups were obviously lower than in H/R group ［(0.905±0.033） mmol·g-1 and （0.986±0.042） mmol·g-1 vs （1.120±0.045）  mmol·g-1, P﹤0.05］; but the SOD activity was significantly higher in HPC group and H/R+ NaHS group than in H/R group ［(16.9±1.0） U·L-1  and （159±1.2） U·L-1 vs （13.3±1.5） U·L-1, P﹤0.05］. During the whole 2 hours of  reoxygenation, the survival rate of cells and the SOD activity in HPC and H/R+ NaHS groups remained higher than in the H/R group, and the activity of LDH and the content of MDA kept to be lower than in H/R group (P﹤0.05).  Conclusion  NaHS postconditioning offers protective effect on myocardial cells against hypoxia/reoxygenation injury by enhancing the scavenging of oxygen - derived free radicals.    Key words： H2S; postconditioning; myocardial cell culture; hypoxia/reoxygenation injury; rat    缺血后处理(ischemic postconditioning)［1］是可以有效对抗缺血/再灌注损伤的一种重要内源性保护机制，长时间缺血后再灌注前，短时间内反复短暂的再缺血处理，可以明显减轻缺血组织的缺血/再灌注损伤。药物后处理是用药物模拟缺血后处理的方式，试图达到与缺血后处理相似的保护效果。内源性硫化氢（H2S）作为新发现的气体信号分子，其心肌保护作用近年来受到高度的关注。研究发现，缺血前给予外源性硫化氢钠（NaHS）可改善因缺血/再灌注损伤（ischemia reperfusion injury, IRI）引起的心肌功能障碍和心肌损伤［2］。但NaHS后处理的心肌保护作用尚未见报道。本研究采用原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞，建立缺氧/复氧损伤模型，探讨NaHS后处理对培养心肌细胞IRI的保护作用及其可能的机制。

    1  材料和方法     1.1  实验材料  胎牛血清（杭州四季青有限公司）；DMEM培养基（GIBCO，America）；胶原酶I、胰蛋白酶（Sigma）；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、超氧化物歧化酶(super oxidedismutase, SOD)、丙二醛 (malondialdehyde, MDA)试剂盒，考马斯亮蓝法蛋白测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所出品；其余试剂均为国产分析纯产品。二氧化碳培养箱（上海），N750紫外分光光度计（上海）。    1.2  实验方法    1.2.1  乳鼠心肌细胞原代培养  选出生1～3天内的Sprague Dawley大鼠（由徐州医学院实验动物中心提供），雌雄不限。参照文献［3］方法分离、纯化心肌细胞，制成浓度为1×109·L-1 的细胞悬液，接种于24孔培养板。取原代培养72 h的心肌细胞进行实验。    1.2.2  实验分组  将同批培养的心肌细胞随机分为4组。①对照组（Normal组）：将心肌细胞放入37℃含95%空气、5% CO2的二氧化碳培养箱中，用复氧液〔mmol·L-1, 0.9 Na2HPO4，20.0 NaHCO3, 1.8 CaCl2，1.2 MgSO4, 55.0 葡萄糖, 20.0 HEPES(hydroxyerhyl piperazine erhanesulfonic acid, 羟乙基哌嗪乙磺酸)，129.5 NaCl和5.0 KCl，pH 7.4〕培养4 h。②缺氧/复氧组（H/R组）:参照文献［3］，将心肌细胞换用高纯氮气饱和30 min、氧分压低于7 kPa的模拟缺氧液(mmol· L-1，0.9 Na2HPO4、6.0 NaHCO3、1.8 CaCl2、1.2 MgSO4、40乳酸钠、20 HEPES、98.5 NaCl和10.0 KCl、pH 6.8)，并置于37℃含95% N2、5% CO2的密闭容器中缺氧2 h，然后换为复氧液在二氧化碳培养箱中复氧2 h。③缺氧后处理组（HPC组）：缺氧2 h后，参照文献［4］方法给予缺氧后处理。先用复氧液培养5 min，然后换为缺氧液培养5 min，复氧液5 min/缺氧液5 min重复3次，共计30 min，再继续用复氧液培养1.5 h。④硫氢化钠后处理组（H/R+NaHS组）：后处理方式同HPC组，用含NaHS复氧液（用复氧液配制，NaHS终浓度为1×10- 6 mo l·L-1，此浓度为预实验所选定）代替缺氧液给予后处理。

    1.2.3  观察指标及检测方法  每组重复6次，在5个时间点（缺氧前、缺氧2 h和复氧后 0.5 h、1 h、2 h）进行指标测定。

    1.2.3.1  台盼蓝排斥试验  制备单细胞悬液，调整细胞浓度为2×10-6·L-1。然后将心肌细胞悬液0.1 ml和4 g·L-1台盼蓝溶液0.1 ml混匀，用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞数。按公式计算细胞存活率：细胞存活率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

    1.2.3.2  LDH活性  收集各个实验组培养基，按照LDH测定试剂盒说明书测定。

    1.2.3.3  测定细胞内MDA和SOD  在各个需检测的时间点，吸去培养液，经超声破碎细胞后离心取上清液，按MDA和SOD测定试剂盒说明书进行测定。

    1.3  统计学处理  计量资料以±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较用 Student Newman Kenlsa法进行q检验。检验水准：α=0.05。

    2  结  果

    2.1  培养心肌细胞的一般特性  采用上述分离纯化方法培养的心肌细胞刚接种时细胞呈球形悬浮在培养液中；培养 4～6 h后开始贴壁生长，逐渐展开，伸出伪足，由圆形变为梭形、三角形或星形；12～24 h细胞基本贴壁，少数单个细胞呈现不同频率的自发性搏动(40～80次/min)；72 h后细胞伸出的伪足相互接触交织成网，逐渐形成细胞簇或细胞单层，呈放射状排列，同步节律性搏动(90～120次/min)，收缩明显而有力，形成功能性合体细胞。

2.2  心肌细胞存活率  缺氧前各组细胞存活率无显著差异（P﹥0.05）。H/R组在缺氧/复氧过程中细胞存活率持续下降，较Normal组显著降低（P﹤0.01）。缺氧2 h时，H/R组、HPC组和H/R+NaHS组细胞存活率无显著差异（P﹥0.05）。但经缺氧后处理和NaHS后处理后（即复氧0.5 h时），HPC组细胞存活率和H/R+NaHS组细胞存活率较H/R组明显增高（P﹤0.05）。虽然随复氧时间延长，HPC组和H/R+NaHS组细胞存活率继续下降，但仍然明显高于H/R组（P﹤0.01）。至复氧2 h时，3组细胞存活率均不再下降，HPC组细胞存活率和H/R+NaHS组细胞存活率依然显著高于H/R组（P﹤0.01）。见表1。 表1  各组心肌细胞存活率的比较与Normal组比较：##P﹤0.01；与H/R组比较：*P﹤0.05,**P﹤0.01

    2.3  心肌细胞培养液LDH活性  缺氧前各组心肌细胞培养液中LDH活性无显著差异（P﹥0.05）。缺氧2 h时H/R组细胞培养液中LDH活性比Normal组显著升高（P﹤0.01），而此时H/R组、HPC组和H/R+NaHS组间LDH活性无显著差异（P﹥0.05）。经缺氧后处理和NaHS后处理后，HPC组LDH活性和H/R+NaHS组LDH活性显著低于H/R组（P﹤0.05）。随复氧时间延长，3组LDH活性均继续升高，但HPC组和H/R+NaHS组LDH活性仍明显小于H/R组；至复氧2 h时，3组细胞培养液中LDH活性均不再增高，然而H/R组LDH活性依然显著高于HPC组LDH活性和H/R+NaHS组（P﹤0.01）。见表2。表2  各组心肌细胞培养液LDH活性的比较与Normal组比较：##P﹤0.01；与H/R组比较：*P﹤0.05，**P﹤0.01

    2.4  心肌细胞内MDA含量  缺氧前各组心肌细胞内MDA含量无显著差异（P﹥0.05）。缺氧2 h时H/R组细胞内MDA含量比Normal组明显增高（P﹤0.01），而此时H/R组、HPC组和H/R+NaHS组间MDA含量无显著差异（P﹥0.05）。经缺氧后处理和NaHS后处理后，HPC组MDA含量和H/R+NaHS组MDA含量明显低于H/R组（P﹤0.05）。随复氧时间延长，3组细胞内MDA含量均继续增加，但HPC组和H/R+NaHS组MDA含量仍明显低于H/R组；至复氧2 h时，3组细胞内MDA含量均不再升高，然而HPC组MDA含量和H/R+NaHS组MDA含量依然明显低于H/R组（P﹤0.01）。见表3。表3  各组心肌细胞内MDA含量的比较（与Normal组比较:##P﹤0.01；与H/R组比较:*P﹤0.05,**P﹤0.01

    2.5  心肌细胞内SOD活性  缺氧前各组心肌细胞内SOD活性无显著差异（P﹥0.05）。缺氧2 h时H/R组细胞内SOD活性比Normal组显著降低（P﹤0.01），而此时H/R组、 HPC组和H/R+NaHS组间SOD活性无显著差异（P﹥0.05）。经缺氧后处理和NaHS后处理后，HPC组SOD活性和H/R+NaHS组SOD活性明显高于H/R组（P﹤0.05）。随复氧时间延长，3组SOD活性继续下降，但HPC组和H/R+NaHS组SOD活性仍明显高于H/R组；至复氧2 h时，3组SOD活性均不再降低，然而H/R组SOD活性依然显著低于HPC组和H/R+NaHS组（P﹤0.05，P﹤0.01）。见表4。表4  各组心肌细胞内SOD含量的比较与Normal组比较：##P﹤0.01；与H/R组比较：*P﹤0.05,**P﹤0.01

    3  讨  论

    心肌缺血/再灌注损伤［5］机制复杂，一般认为，膜损伤、自由基生成增多、细胞内钙超载、中性白细胞聚集等主要机制互为因果；其中氧自由基增多引起的一系列反应和损伤在这些机制中占有重要地位。缺氧/复氧损伤（hypoxia reoxygenation injury, HRI）［6］与IRI实质上非常相似。本实验中H/R组心肌细胞存活率下降，LDH释放增加，心肌细胞内SOD活性降低，脂质过氧化产物MDA水平增高，表明HRI过程中脂质过氧化反应剧烈，而且复氧早期更为显著，进一步证实HRI损伤与氧自由基大量产生有关。而HPC组经缺氧后处理后，与H/R组相比，心肌细胞存活率明显增加，LDH释放减少，细胞内MDA水平降低而SOD活性显著增高。表明缺氧后处理可以提高心肌细胞清除氧自由基的能力，降低心肌细胞脂质过氧化反应，是对抗HRI的一种有效措施；同时也说明心肌细胞的缺血后处理模型已经建立。

 虽然缺血后处理确切的保护效果得到了肯定，但缺血本身是损伤性的应激过程，实施缺血后处理临床难以接受。因此，寻找药物后处理在心肌HRI的保护研究中具有十分重要的地位。药物后处理是用药物模拟缺血后处理的方式，试图模拟或者激发缺血后处理中的心肌保护机制或者一些内源性的物质，而呈现与缺血后处理相似的对抗HRI的保护效果。

    内源性硫化氢［7］是体内含硫氨基酸的代谢终末产物。作为新发现的气体信号分子，H2S在心血管系统中发挥着重要的生理与病理生理学效应，主要包括：舒张血管、负性肌力、抑制血管重构、心肌保护［7］，并与肺动脉高压形成有关，还参与感染性和内毒素性休克的病理生理。其中H2S的心肌保护作用近年来受到高度的关注。已有研究表明在缺血前给予外源性NaHS，可改善因IRI引起的心肌功能障碍和心肌损伤［2］。本实验采用NaHS作为外源性H2S供体，因为NaHS在体内可解离成Na+和HS-，HS-可以和体内H+结合生成H2S，而内源性H2S的存在方式本身就为：1/3由未分解的H2S形式存在，2/3以HS-形式存在，两者为一动态平衡；所以NaHS后处理的实质为H2S后处理［8］。H/R+NaHS组经NaHS后处理后，与H/R组相比，细胞存活率显著增加、LDH漏出明显减少；同时NaHS后处理后细胞内MDA水平降低，SOD活性增高，提示NaHS后处理同缺氧后处理一样，也能激活心肌细胞SOD，减少氧自由基的生成。NaHS后处理与缺氧后处理可以产生相似的保护效果，但其保护作用没有缺氧后处理强。

    Johansen等［2］证实H2S作为迄今发现的惟一的内源性血管平滑肌KATP通道开放剂，可以通过开放KATP通道，参与了缺血预处理的心肌保护作用。Geng等［9］采用异丙肾上腺素复制心肌缺血模型，发现给予外源性H2S供体可以通过直接清除自由基从而降低心肌缺血大鼠的死亡率。因此NaHS后处理中还可能通过H2S直接清除自由基，开放KATP通道参与了对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用。

    综上所述，NaHS后处理能部分模拟缺氧后处理,通过提高心肌细胞SOD活性，增加氧自由基的清除，减轻心肌细胞的缺氧/复氧损伤，其中涉及的其他机制还有待进一步明确。

【参考文献】  ［1］ Zhao ZQ, Corvera JS, Halkos ME , et al . Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparision with ischemic preconditioning［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2003, 285(2) : H579-H588.

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［8］ Lowicka E, Beltowski J. Hydrogen sulfide (H2S) - the third gas of interest for pharmacologists［J］. Pharmacol Rep，2007，59(1): 4-24.

［9］ Geng B, Chang L, Pan C, et al. Endogenous hydrogen sulfide regulation of myocardial injury induced by isoproterenol［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2004，318(3):756-763.