COX-2基因启动子区-765G/C多态性与昆明地区汉族人2型糖尿病的相关性研究

　　作者：周晰溪　宋滇平 作者单位：650032　昆明医学院第一附属医院糖尿病科

　　【摘要】 目的　探讨环氧化酶2(COX-2)基因启动子区-765G/C多态性与昆明地区汉族人2型糖尿病(T2DM)的相关性。方法　采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法，对200例T2DM患者、100例健康对照者(NC)的COX-2基因-765G/C多态性进行检测;比较分析两组间基因型频率和等位基因频率及相关资料。结果　(1)基因型频率和等位基因频率在两组的差异无统计学意义。(2)T2DM患者中，-765GG型携带者的空腹血糖水平、餐后2 h血糖水平和糖化血红蛋白百分比水平与非GG型携带者相比，差异有统计学意义。结论　在昆明地区汉族人群中虽COX-2基因-765G/C多态性与T2DM发病无明显相关，但-765GG基因型能影响T2DM患者血糖水平。

　　【关键词】 糖尿病，2型;　环氧化酶2;　多态性，限制性传段长度

　　2型糖尿病(T2DM)是一个从胰岛素抵抗为主伴胰岛素相对不足到胰岛素分泌不足为主伴胰岛素抵抗的过程，是复杂的多基因疾病，存在明显的异质性。从分子水平研究其遗传易感性，在预防控制T2DM中显得尤为重要。

　　有观点认为，糖尿病是一种慢性、低度的炎症性疾病[1]。环氧化酶2(Cyclooxygenase，COX-2)是一种重要的炎症介质，COX-2基因启动子区与COX-2蛋白表达密切相关，本研究旨在探讨云南昆明汉族人COX-2基因-765G/C(rs20417)多态性与T2DM的关系。

　　一、对象与方法

　　1. 研究对象：T2DM组共200例，男119例，女81例，平均(55.45±8.75)岁，为昆明医学院第一附属医院糖尿病科住院的云南籍汉族患者，彼此间无血缘关系。T2DM诊断依据按1999年WHO诊断标准。排除原发高血压、脑血管疾病。正常对照组(NC组)共100例，男47例，女53例，平均年龄(46.8±9.25)岁，为昆明医学院第一附属医院健康体检中心筛选的无血缘关系的云南籍汉族健康体检者。

　　2. 基因组DNA提取及聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)反应：用含EDTA抗凝管采静脉血3 ml,2000 r/min离心5 min以分离白细胞，用柱式小量血液基因组DNA抽提试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)抽提DNA。按文献[2]合成扩增引物，上游引物5′-ATTCTGGCCATCGCCGCTTC-3′，下游引物5′-CTCCTTGTTTCTTGGAAAGAGACG-3′。PCR反应体系：模板3 μl，Buffer 5 μl，MgCl2溶液3 μl，dNTP Mix 1 μl,10 μmol/L的上、下游引物各2 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，双蒸水补足体系至50 μl。反应条件：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s;60 ℃退火30 s;72 ℃延伸10 s;共33个循环，终末72 ℃延伸5 min。取扩增成功的产物用限制性内切酶Bsh1236Ⅰ在37 ℃水浴消化6 h。

　　3. 相关指标测定：日本奥林巴斯AU5400型全自动生化分析仪检测空腹血糖(FPG)水平和餐后2 h血糖(2hPG)水平等生化指标，用乳胶增强免疫比浊法测定糖化血红蛋白百分比水平(HbA1c%)。

　　4. 统计学分析：用Hardy-Weinberg平衡检验所选样本的群体代表性。比较各组基因型频率和等位基因频率用χ2检验。计量资料以均数±标准差(x-±s)描述，组间均数比较用t或t′检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　二、结果

　　1. COX-2基因特异性片段PCR-RFLP方法分析结果及COX-2基因-765位点基因型频率和等位基因频率在两组间的比较：(1)COX-2基因多态性分析：将PCR产物以85 V电压条件下在2%琼脂糖凝胶上做电泳;将酶切后产物以85 V电压条件下在3%琼脂糖凝胶上做电泳。PCR扩增片段长度为157 bp，酶切后产物在3%琼脂糖凝胶上表现是：-765GG型为133 bp一条片段;-765CC型为157 bp的一条片段;-765G/C型为157 bp、133 bp两条片段(图1,2)。(2)研究群体Hardy-Weinberg平衡检验：经χ2检验，各组人群基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，所选样本具有群体代表性。(3)T2DM组的-765位点的各基因型频率分布与NC组比较，差异无统计学意义(χ2=0.915，P>0.05)。两组间各等位基因频率分布均差异无统计学意义(χ2=1.842，P>0.05)(表1)。

　　2. 不同性别的-765G/C多态性比较(表2,3)：无论在男性或是女性，T2DM组与正常对照组间在基因型、等位基因频率上均无统计学差异(P>0.05)。

　　3. 在T2DM患者中-765G/G基因型携带者与非G/G基因型携带者相比：FPG[(8.85±4.71)mmol/L vs.(7.21±2.65)mmol/L]、2hPG[(12.48±6.0)mmol/L vs.(10.50±4.23)mmol/L]、HbA1c%(8.84±2.76 vs.7.94±2.17)差异均有统计学意义(P<0.05)。表1　T2DM组和NC组-765位点基因型频率和等位基因频率表2　T2DM组和NC组-765位点基因型频率和等位基因频率在男性的分布表3　T2DM组和NC组-765位点基因型频率和等位基因频率在女性的分布

　　三、讨论

　　COX是花生四烯酸代谢过程中前列腺素(prostaglandins，PGs)合成的限速酶，COX-2是COX的一种亚型，属诱导型酶。炎症细胞因子、氧化应激等在T2DM中具有重要作用，T2DM和亚临床炎症有密切联系。COX-2作为重要的炎症介质，参与糖尿病的发病机制以通过诱导合成PGs类衍生物来实现，同时COX-2作为炎性反应的介质，能降低人体对胰岛素的敏感性。

　　本研究运用PCR-RFLP方法检测研究对象-765G/C多态性，以望发现该遗传变异与昆明地区T2DM人群发病的内在联系。

　　我们发现中国昆明健康汉族人-765G/C各基因型频率分布是85.0% GG、15.0% GC、0 CC，与印度北方健康人群(71.0% GG、25.7% GC、3.3% CC)和荷兰阿姆斯特丹地区健康人群(59.0% GG、32.0% GC、9.0% CC)[3]相比都有很大差异，与北京市健康汉族人(96.0% GG、4.0% GC、0 CC)[4]也不等同。同时，在我们的研究中发现昆明地区汉族健康人群-765G等位基因的基因频率是92.5%;-765C等位基因的基因频率是7.5%，与甘肃宁夏地区回族健康人群(87.6% G、12.4% C)[5]有差别。提示-765G/C基因型和等位基因频率的分布存在种族差异、地区以及民族差别的特点。

　　将T2DM组同NC组比较：COX-2基因-765位点的各基因型频率和等位基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05)，提示COX-2基因-765G/C与昆明地区人群T2DM发病无显著相关关系。Szczeklik等[6]认为-765位点的基因型差异可能与性别有关。而在我们的研究显示，无论是在男性或是女性，其-765位点基因型频率和等位基因频率在T2DM者和健康者间的分布差异均无统计学意义，造成差异的原因可能与种族遗传背景不同有关。

　　在本研究中虽未发现-765G/C多态性与T2DM发病的相关性，但发现-765G/G型能使T2DM患者血糖水平升高。产生此现象的具体机制不明确，可能与-765G/G基因型能影响COX-2蛋白表达有关。有研究[7-8]认为该变异处于转录因子Sp1结合位点，G→C突变使Sp1不能与该位点结合，从而降低了启动子活性。COX-2蛋白表达上调会影响胰岛素分泌，并在胰岛β细胞的病理生理过程中发挥重要作用。本研究得出的观点仍需要进一步扩大样本量研究论证，以最小限度消除地域和人种等因素的影响。

　　(本文图片见光盘)

　　【参考文献】

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