阿托伐他汀治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎

作者：潘满冬, 谭利明, 卢伟, 黄继义   作者单位：中南大学湘雅二医院神经内科,长沙 410011  【摘要】  目的 探讨阿托伐他汀对Wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的治疗作用。 方法 建立Wistar大鼠EAE模型,给予不同剂量阿托伐他汀处理,观察大鼠发病程度、病理改变及血清白细胞介素4(IL4)、干扰素γ(IFNγ)水平的变化。 结果 阿托伐他汀可减轻大鼠发病程度,减少炎性病灶数,降低血清IFNγ水平升高幅度,使血清IL4水平在发病初期即升高,高剂量阿托伐他汀作用更显著。 结论 阿托伐他汀在一定程度上可有效干预大鼠EAE发病,并呈剂量相关性,其机制可能与改变Th1/Th2类细胞因子比值有关。

【关键词】  吡咯类; 脑脊髓类; 自身免疫性,实验性; 脑脊髓炎; 白细胞介素4; 干扰素Ⅱ型

　　ABSTRACT:  Objective  This study was designed to explore the effects of atorvastatin, an inhibitor of HMGCoA reductase on the experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE) in Wistar rats.  Methods  Atorvastatin was administered at two different doses to Wistar rats EAE model.  A scale of 0-5 according to the symptoms scored the severity of EAE.  The numbers of inflammation lesion in the brain and spinal cord were counted by optical microscopy.  The serum levels of interferonγ and interleukin4 were determined by enzymelinked immunosorbent assay.  Results  Compared to the untreated group, the atorvastatin groups only partially developed EAE with a lighter degree of malfunction.  The numbers of inflammation lesion reduced significantly in atorvastatin treated groups.  The serum level of interferonγ increased in atovarstatin treated groups with the development of EAE, but was lower than that in the untreated group.  The serum levels of interleukin4 in atorvastatin groups were higher at the onset.  Higher dose atorvastatin showed better protection against EAE development.  Conclusion  To a certain extent atorvastatin could effectively ameliorate EAE in rats.  The effects were in a dosedependent fashion, which might be mechanistically related to the balance between Th1/Th2 cytokines.    　　KEY WORDS:  experimental autoimmune encephalomyelitis; atorvastatin; IL4; IFNγ

　　多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种由免疫细胞介导攻击中枢神经系统髓鞘为特征的自身免疫性疾病,好发于青壮年,是青壮年人群致残的常见疾病之一。目前临床上经美国FDA批准用于治疗MS的药物有:β干扰素(IFNβ)、格拉默(Glatiramer acetate)和米托蒽醌(Mitoxantrone)等。这些药物作用有限,且有非肠道给药、价格昂贵、不良反应发生率高等缺点,故有必要寻找新的更安全有效的治疗药物。他汀类药物主要用于降脂治疗,近年来发现其具有独立于降脂作用的免疫调节作用的多效性[1]。笔者研究阿托伐他汀对人MS的经典动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型的影响,探讨其在EAE中的可能作用机制。

　　1  材料和方法

　　1.1  主要材料  白细胞介素4（IL4）和IFNγ ELISA试剂盒(北京晶美生物工程有限公司);阿托伐他汀(辉瑞制药有限公司);豚鼠和雌性Wistar大鼠[湖南农业大学实验动物养殖场:许可证号SCXK(湘)20030003],8～10周龄,体质量180～220 g。　　1.2  动物  健康雌性Wistar大鼠60只,随机分成4组:对照组，EAE组(蒸馏水灌胃),阿托伐他汀干预一组(阿托伐他汀1 mg·kg-1·d-1)和阿托伐他汀干预二组(阿托伐他汀10 mg·kg-1·d-1)。每组再随机分成3小组,每小组各5只,分别自免疫接种日开始灌胃至第8,11,17天。

　　1.3  免疫原乳剂的制备及模型的建立  参照文献[23]法,取体质量300～400 g豚鼠处死后,在无菌操作下,迅速剥出脊髓,制成50%(M/V)的豚鼠脊髓匀浆,再与等量的完全福氏佐剂(含6 mg/mL卡介苗)充分混合,制成免疫原乳剂。大鼠两后足垫内各注射等量免疫原乳剂(共计100 g/0.2 mL),同时尾根皮下注射百日咳疫苗(5.8×1010mL-1)0.2 mL。对照组免疫原乳剂中的豚鼠脊髓匀浆用等量的生理盐水代替,余同其他组。    　　大鼠免疫接种后每日称体质量,观察病情并进行神经功能障碍评分。神经功能障碍评分标准采用5分评分法[4]:0分,无明显异常;1分,大鼠尾部无力麻痹;2分,尾部无力+后肢无力;3分,后肢轻度麻痹;4分,后肢严重麻痹伴前肢无力,被动翻身不能复原;5分,全身瘫痪或濒临死亡。

　　1.4  血清中IL4和IFNγ水平检测  各组3小组分别于免疫接种后第8,11,17天(相当于EAE组发病初期、高峰期和缓解期),通过摘除眼球取全血1.5 mL,离心后获得血清于-20 ℃冰箱保存待检。用ELISA法检测IL4和IFNγ水平。

　　1.5  病理检查  取各组中免疫接种后第11天(相当于EAE组发病高峰期)的大鼠各5只,断头处死后,剥取脑和脊髓用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋。取大脑顶叶、小脑脑干及腰髓切片,进行常规HE染色和Weil’s髓鞘染色。光镜下按呈袖套样改变或超过15～20个炎性细胞浸润者称为1个炎性灶进行病灶计数,将各节段病灶数相加后取均数,进行显著性检验。

　　1.6  统计学处理  数据采用x±s表示。成组设计多个样本均数比较用方差分析,组间均数比较用LSDt检验。发病率比较用χ2检验。以P<0.05为差别有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  动物发病情况  EAE组大鼠在致敏后约7～10 d陆续出现活动减少,体质量减轻,尾部麻痹,双后肢瘫痪,严重者四肢瘫痪,伴大小便失禁,甚至出现濒死状态。整个病程持续8～10 d,发病率100%。对照组均无发病。阿托伐他汀干预一组和干预二组发病率分别为60%和40%,其中干预二组与EAE组比较,差别有统计学意义。两干预组平均发病潜伏期相对EAE组延后1～2 d,临床症状相对较轻,尤以发病高峰期干预组和EAE组比较临床症状明显减轻(表1,图1)。

　　表1  EAE组和干预组各期临床神经功能障碍评分（略）

　　Tab 1  The clinical scores at different periods

　　EAE：实验性自身免疫性脑脊髓炎.  与EAE组同期比较,☆:P<0.05; 与干预一组同期比较,＃:P<0.05.

　　图1  实验性自身免疫性脑脊髓炎发病大鼠（略）

　　Fig 1  A rat in disease state

　　2.2  血清细胞因子的变化  与对照组比较,EAE组血清IFNγ水平在发病初期即升高,并随病情加重进一步升高,到免疫接种后第11天临床神经功能评分达高峰时,IFNγ水平亦达到高峰,而血清IL4水平在发病缓解期升高。阿托伐他汀干预组血清IFNγ水平也出现升高,但升高幅度显著低于EAE组,而血清IL4水平在发病初期即出现升高,在缓解期更明显。IFNγ水平升高的降低程度和IL4水平的升高程度,随着药物剂量增加而更加明显(图2)。

　　2.3  病理观察  EAE组脑和脊髓内小血管尤其是    A:对照组; B:EAE组; C:干预一组; D:干预二组. 与对照组同期比较,☆:P<0.01; 与EAE组同期比较,△:P<0.05; 与干预一组同期比较,＃:P<0.01.

　　图2  大鼠血清IFNγ和IL4水平（略）

　　Fig 2  The serum levels of IFNγ and IL4

　　小静脉周围大量炎性细胞浸润,血管袖套样改变。浸润的炎性细胞类型以淋巴细胞为主,亦可见胶质细胞和一定数量的巨噬细胞,伴有海马锥体细胞和脊髓前角运动神经元变性。对照组无病理改变。阿托伐他汀干预组可见类似EAE组病理改变(图3)。EAE组、阿托伐他汀干预一组和干预二组的病灶数分别为(11.96±1.83),(5.25±0.98)和(3.16±0.94)。两干预组病灶数较EAE组明显减少(P<0.01),尤以干预二组为甚(与干预一组比较,P <0.05)。而在Weil’s髓鞘染色中,仅EAE组少数大鼠在脑干和小脑白质内可见片状脱髓鞘,对照组与药物干预组均未发现明显脱髓鞘改变。

　　3  讨论

　　3.1  EAE模型血清IFNγ、IL4变化特点  EAE是一种获得性髓鞘脱失的动物模型,在临床、病理等方面与MS极其相似,是MS的经典动物模型[5]。本实验在建立Wistar大鼠EAE模型基础上,观察不同剂量的阿托伐他汀对EAE大鼠的治疗作用。    　　MS和EAE是细胞免疫与体液免疫均参与的错综复杂疾病,但以细胞免疫为主[6]。而CD4+Th细胞是主要参与的免疫应答细胞,根据生成细胞因子的不同,CD4+Th细胞又可分为Th1和Th2两个亚群。Th1类细胞因子主要有IL1、IL2、IL12、TNFα和IFNγ等;Th2类细胞因子主要有IL4、IL5和IL10等。在正常情况下,Th1/Th2细胞因子互相拮抗处于动态平衡,使机体处于免疫稳定状态;病理情况时,两者平衡被打破,Th1细胞因子水平上升,Th2细胞因子水平下降,则导致细胞免疫介导的炎性疾病发生。

　　A:EAE组小脑内小血管周围炎性细胞浸润; B:阿托伐他汀干预一组小脑小血管周围炎性细胞浸润; C:阿托伐他汀干预二组小脑内小血管周围炎性细胞浸润; D:EAE组海马颗粒细胞变性; E:EAE组脑干内脱髓鞘病灶.  EAE：实验性自身免疫性脑脊髓炎.  A～D:HE染色  ×100.  E:Weil’s染色  ×100.

　　图3  EAE组和阿托伐他汀干预组大鼠病理改变（略）

　　Fig 3  The pathologic changs in EAE group and atorvastatin treated groups

　　本实验通过双抗体夹心ELISA法检测大鼠血清中细胞因子水平。结果显示,EAE组血清IFNγ水平在发病初期即出现升高,在发病高峰期亦达到高峰,随着病情缓解而下降;与对照组相比,其差别具有统计学意义(P<0.05)。并且,血清IFNγ水平的变化趋势与大鼠神经功能障碍评分、病理改变中的炎性病灶数目变化趋势相同,提示IFNγ参与了大鼠EAE的发生和发展,呈促进炎症作用。而EAE组血清IL4水平早期轻度下降,与对照组相比无差异性;在病情缓解期出现升高,与对照组相比差别具有统计学意义(P<0.05),此与Begolka等发现到EAE病情缓解期才能检测到IL4 mRNA的表达相吻合[7],说明IL4参与疾病的缓解过程,起到抑制炎症作用。

　　3.2  阿托伐他汀对EAE模型具有一定干预治疗作用  他汀类药物是一种3羟基3甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂,是当前调脂药物中最有效的一类药物。近年来其非降脂作用屡见报道[1]。他汀类药物非降脂作用的可能机制是通过抑制HMGCoA还原酶,阻断甲羟戊酸下游中间产物的产生,包括焦磷酸法呢酯(FPP)、焦磷酸牻牛儿基牻牛儿基酯(GGPP)等类异戊二烯化合物,进而阻断Ras、Rho、Rac等蛋白的异戊二烯化,影响细胞的增殖、分化和迁移作用[8]。    　　阿托伐他汀是他汀类药物中安全性能最好的药物之一。本实验发现干预组与模型组相比发病率明显下降,发病日相对推后,病情严重程度明显下降,病理检查所示病灶数也显著减少,显示阿托伐他汀具有干预治疗大鼠EAE作用。血清标志性的细胞因子检测结果表明这种干预治疗作用可能与阿托伐他汀下调IFNγ的促炎作用及上调IL4的抑炎作用相关。其可能机制是:阿托伐他汀降低IFNγ分泌,减少抗原递呈细胞(APC)上MHCⅠ、MHCⅡ类分子的表达,阻断抗原递呈作用,降低外周T淋巴细胞的激活;亦减少血管内皮细胞上粘附分子的表达,阻断T淋巴细胞通过血脑屏障,使中枢神经系统炎症反应及组织破坏减轻[1]。同时阿托伐他汀增加IL4分泌,而IL4可通过增加T细胞IL4受体的表达,并与受体结合后激活细胞内信号传导和转录激活因子6(STAT6),诱导Th2类细胞因子相关基因的表达,从而增加Th2细胞的效应[9]。　　参考Nath等的研究报道[10],本实验中血清细胞因子变化机制可能是:阿托伐他汀通过抑制NFκΒ和Tbet(T盒子转录分子)的表达,并阻断JAKSTAT4通道,从而阻断Th0细胞向Th1细胞分化,减少Th1类细胞因子(IFNγ、TNFα)的分泌有关;另一方面,阿托伐他汀诱导GATA3(IL4的主要调控子)的表达和STAT6磷酸化,促使Th0向Th2细胞分化,增加Th2类细胞因子(IL4、IL5、IL10)分泌。实验中两不同剂量组比较,高剂量组(10 mg·kg-1·d-1)的神经功能障碍评分、病理检查中病灶数、血清IFNγ水平升高的幅度均显著低于小剂量组(1 mg·kg-1·d-1),而血清IL4水平升高的幅度显著高于小剂量组,提示在一定范围内阿托伐他汀剂量越大,干预治疗作用越明显。

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