亚甲蓝光化学法病毒灭活对血浆成分及 白细胞残留量的影响

输血是临床抢救和治疗患者的重要手戥之一,但也具有传染疾病的危险。血液成分中传播病毒危险性最大的是白细胞,其次为血浆,因此对血浆进行病毒灭活并滤除白细胞成为保障输血安全的主要措施之一。目前,我国采供血机构对血浆进行病毒灭活,常用方法是亚甲蓝光化学法(methylenebluephot°chem“try,MBP),该方法在欧洲国家中应用较为普遍[I],是我国目前唯一获准用于临床的光化学血浆病毒灭活技术。M⒊P几乎可灭活所有细胞外的脂质包膜病毒,但对细胞内的病毒不具各灭活作用,因此采用MBP灭活血浆病毒的同时,还要对血浆中的白细胞进行滤除[2]。M⒊P在病毒灭活过程中对血液成分的结构和功能可能有一定的影响,Williamson等[3]总结了多项研究中亚甲蓝光化学病毒灭活对血浆成分的影响、凝血因子等的活性减少可达4%~32%。为了解常规工作流程下病毒灭活血浆中主要凝血因子等的状况,研究病毒灭活过程对血液质量的影响,现对病毒灭活前后的血浆进行抽样检测,报告如下。

材料与方法

1 标本来源均来源于淮北市中心血站⒛13年6月无偿献血血液标本,随机抽取应用去白细胞四联袋采集的30份400ml全血,利用采血后6h内的制各新鲜血浆,在百级净化间内无菌连接血浆袋和病毒灭活过滤器,使血浆缓慢通过MB添加元件,血浆中亚甲蓝终浓度为1um。l/L,将含有亚甲蓝的血浆流入病毒灭活耗材的一个空袋中,混匀后留样10ml备检。然后将加人亚甲蓝的血浆置4C病毒灭活箱的搁架上,摆动频率60次/mlll,利用30000~35000LX光照强度的可见光照射30min,将光照后的血浆通过病毒灭活过滤器滤除残余的亚甲蓝和白细胞,混匀后留样10ml备检。

2 主要仪器与试剂四联采血袋(山东威高医用品股份有限公司,批号1304282),含有MB添加元件的病毒灭活柜配套一次性病毒灭活血袋(上海输血技术有限公司,批号130307),凝血因子Ⅱ、V、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、X、Ⅺ、Ⅻ活性和纤维蛋白原(Fg)含量的测定试剂盒(SIEMENS,批号546553A),总蛋白(TP)试剂盒(上海科欣生物技术研究所,批号20130405),6000I离心机(德国贺利氏),DXZⅡ型低温操作台(郑州飞龙医疗设各有限公司),CA50全自动血凝仪(日本Sysmex公司),HDME1A型医用血浆病毒灭活柜(上海输血技术有限公司)。

3 凝血因子和总蛋白含量的检测凝血因子Ⅱ、V、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、X、Ⅺ、Ⅻ的活性及Fg含量测定采用血凝仪,TP含量测定采用双缩脲法,严格依据检测试剂说明书操作。

4 白细胞计数采用Nageotte血细胞计数板计·291·数。白细胞滤除率=(滤除前血浆白细胞数-滤除后血浆白细胞数)/滤除前血浆白细胞数×100%。

5 统计方法采用SPSS13.0软件进行统计学处理,计量数据以均数±标准差(Ⅰ±s)表示,处理前后各指标的比较采用配对矽检验。

结果

1 对血浆中凝血因子的影响经亚甲蓝光化学法处理30min后,血浆中凝血因子活性在处理后均有不同程度的损伤,多数在80%以上。血浆凝血因子V和Ⅷ活性减少明显,差异有统计学意义(P<0.05),其他凝血因子活性减少不明显(P<0.05),

2 对血浆Fg和TP含量的影响血浆中Fg含量【g/L)下降了8.02%,TP含量(g/I')仅下降了3.91%,差异无统计学意义(P>0.05),

3 白细胞滤除效果白细胞滤除前新鲜血浆含有白细胞数为(5.72±1.56)×106个/U,白细胞滤过和亚甲蓝光照处理后新鲜血浆白细胞残留量(1.14±0.37)×104个/U(″=30),白细胞去除率>99.80%。

讨论

MBP是一种安全、有效,适用于单袋血浆病毒灭活的方法:l,M⒊P在灭活病毒的同时可能对凝血因子和蛋白有一定的负面作用,造成血浆有效成分的损失[5]。本次研究表明,血浆病毒灭活前、后有效成分的含量发生改变。M⒊P可使血浆中的凝血因子含量降低,对稳定凝血因子及血浆蛋白影响不大。血浆凝血因子FⅡ、FⅦ、FⅨ、FX、FⅪ和FⅪ的回收率分别为91.11%、91.08%、89.14%、92.63%、90.79%和93.60%,血浆Fg和TP回收率分别为91.98%和96.39%,病毒灭活前后差异无统计学意义。不稳定的凝血因子FⅤ和FⅧ活性明显降低,回收率分别为84.19%和82.56%,差异有统计学意义,但仍在国家质量标准允许范围内(新鲜冰冻血浆Ⅷ含量≥0.7IU/ml;病毒灭活新鲜冰冻血浆Ⅷ含量≥0.5IU/ml)。其主要原因是FⅧ、Fv属不稳定凝血因子,离体后受外界的温度及离体时间的影响,外界温度越高,离体时间越长,含量或活性下降越明显。另一方面,亚甲蓝在可见光照射时产生的自由基(一类机制),或单线态氧(二类机制)氧化损伤病毒分子结构使其核酸断裂、复制终止的同时,也对血浆一些蛋白成分造成损伤[6]。文献[7’引认为光照强度30000Lux、光照时间30min,温度(4±2)C的MBP处理条件既可有效灭活病毒又对凝血因子活性改变影响最小,该条件对外源性凝血系统影响不大,但对内源性凝血系统(主要是FⅧ)有一定影响。马改娣等[9□也证实经亚甲蓝灭活后血浆FⅧ:C和Fv:C比灭活前活性均明显降低,与本次研究结果基本相同。实验所用的MBP血浆病毒灭活方法不仅破坏了病毒穿透、复制及感染能力,抑制了病毒的传播,同时还滤除了血浆中残留的白细胞。血制品中残留白细胞含量与输血安全性密切相关。白细胞内不仅含有潜在的致病因子,同时还与非溶血性发热反应、HI冫A同种免疫、血小板输注无效等疾病相关。研究表明:一般每单位血浆中残余白细胞的数量约为105~107,浓度虽不高,但仍可导致与白细胞相关的输血不良反应,更重要的是可携带如巨细胞病毒(CMV)、人类嗜T淋巴细胞病毒I型(HTLVI)、疱疹病毒(HTV)等输血相关病毒[lO]。由于白细胞在血制品保存过程中产生的细胞因子等生物活性物质无法用白细胞滤器滤除,所以保存前给予滤除,既可以减少由白细胞数量和相关代谢产物所导致的不良输血反应,也可避免由亲白细胞病毒、微生物等传染性病原体导致的血源性感染。因此各国对血制品中残留白细胞的含量均有严格的限定。欧洲现行标准是每个血制品包装中应少于1×106个白细胞。M⒊P法中的白细胞滤除属于储存前过滤,因为在8~72h内过滤血液,白细胞没有破碎,也未释放出细胞因子,经MBP灭活的血浆白细胞含量降至104个,最大限度地降低了输血不良反应的发生,大大提高了血浆输注的安全性E5]。本试验中新鲜血浆经新型联袋一次性使用去白细胞输血滤器滤除,结果显示经MBP灭活血浆,每袋血浆约210~230ml,灭活后血浆中白细胞数量由(5.72±1.56)×106个/U下降到(1.14±0.37)×104个/U,白细胞去除率>99.80%,白细JChnTransfusLabMed,July。2014,V°116,N°。3胞数量降低2个数量级,可有效预防非溶血性发热反应、HLA同种免疫及亲白细胞病毒的传播[6]。血浆是可发生经输血传播疾病的主要血液成分之一,近年的用量持续增加,因此在保证血浆临床输用安全的同时,提高血浆质量和应用效果是非常重要的。本研究表明,经过亚甲蓝光化学技术灭活病毒的血浆,对血浆成分的影响较小,灭活后的血浆符合国家相关标准,可以满足临床安全输血的需求,对提高输血安全水平有一定的作用。

参考文献

1 王飞,路志浩,古醒辉,等。亚甲蓝光化学法血浆病毒灭活前后血浆成分的变化D].临床输血与检验,2010,12(2):97-100。

2 赵莉,赵燕.联合应用滤除白细胞和亚甲蓝光化学病毒灭活对新鲜血浆成分的影响D].中国输血杂志,2011,24(8):679-682。

3 钟锐,刘嘉馨,曹晔,等。亚甲蓝光化学法对血浆凝血因子活性的影响研究EJ△中国输血杂志,⒛11,24(1):4042

4 宋敏,赵树铭,刘凤君,等。亚甲蓝血浆病毒灭活对凝血因子的影响EJ]。重庆医学,2012,41(11):1092△094.

5 马改娣,张关萍,田志彬,等。病毒灭活对血浆中各种成分回收率的影响D].中国输血杂志,⒛09,22(3):21⒏219.

6 李卉,李健,杨丽,等。白细胞滤除对新鲜冰冻血浆质量影响的研究EJ].北京医学,⒛09,31(12):74⒍748.