抗TGFβ2抗体对青光眼滤过泡瘢痕成纤维细胞周期的影响

作者：廖海兰    作者单位：广东医学院附属医院眼科，广东湛江 524001

【摘要】  观察抗转化生长因子β2抗体(抗TGFβ2抗体)对体外培养的滤过泡成纤维细胞（FB）周期的影响。方法 利用手术修复青光眼小梁切除术后失败滤过泡时切除下来的瘢痕组织进行原代细胞培养，获得FB。将浓度为0、0.01、0.1、1mg/L的抗TGFβ2抗体作用于FB 24h以及用半数抑制率（IC50）0.14mg/L作用0、24、48、72h，通过流式细胞仪（FCM）检测抗TGFβ2抗体对细胞周期的影响。结果 随着抗TGFβ2抗体浓度增大及作用时间的延长，FBG1期细胞百分数增多，而S、G2期的细胞含量逐渐减少，FB增殖指数呈下降趋势(P<0.05)。结论 抗TGFβ2抗体能阻断FB从G1进入S期，使细胞停滞在G1期，从而抑制细胞的增殖过程。

【关键词】  滤过泡 成纤维细胞 抗TGFβ2抗体 细胞周期

　Role of antiTGFβ2 antibody in cell cycle of fibroblasts in filtering bleb of glaucoma

　　LIAO HaiLan,LIANG XuanWei,WEI JianChu

　　(Department of Ophthalmology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China；Zhongshan Ophthalmic Center,Sun Yatsen University,Guangzhou 510060,China)   　　Abstract: Objective  To observe the role of antiTGFβ2 antibody in the cell cycle of cultured fibroblasts in filtering bleb.Methods  Fibroblasts were isolated from the filtering bleb after trabeculectomy in patients with glaucoma. The primary cells were treated with antiTGFβ2 antibody at different concentrations (0, 0.01, 0.1 and 1 μg/ml) for 24 hours and at IC50 (0.14 μg/ml) for 0, 24, 48 and 72 hours, and then their cell cycles were determined by flow cytometry.Results  Percentage of G1 cells increased, but that of S and G2 cells and proliferation index decreased with the concentration and action time of antiTGFβ2 antibody (P<0.05).Conclusion  AntiTGFβ2 antibody may inhibit fibroblast proliferation by arresting G1 cells.    　　Key words:filtering bleb; fibroblasts; antiTGFβ2 antibody; cell cycle    　　青光眼滤过性手术是治疗青光眼的主要手段，手术后由于血房水屏障的破坏以及手术区的炎症反应，成纤维细胞(FB)大量增殖，导致结膜下组织纤维化和滤过泡瘢痕形成，这是滤过手术失败的最常见和最主要的原因，因此解除手术后滤过泡瘢痕形成是青光眼治疗中的一个重要课题。多种生长因子都能调控FB的生物学行为。研究表明，转化生长因子β2(TGFβ2)在瘢痕形成过程中具有重要的作用，TGFβ2被认为是伤口细胞外基质积聚、收缩和异常修复的关键性调控因素［1］，并在青光眼滤过泡瘢痕化中具有重要作用［2］。人单克隆抗转化生长因子β2抗体（rhAntiTGFβ2 mAb）是一种新型的重组的人抗TGFβ2单克隆抗体，它可以中和体内的TGFβ2，阻滞其发挥生物学效应，而且不影响人眼的正常免疫过程。目前尚未见有关抗TGFβ2抗体对FB的细胞周期影响的报道。为此，本研究利用流式细胞仪检测抗TGFβ2抗体对FB周期的影响。    　　1  材料与方法    　　1.1  材料      　　主要试剂与仪器：抗TGFβ2抗体(Cambridge Antibody Technology Cambs UK)，胎牛血清(Fetel calf serum, FCS), SANYO MCO15A CO2培养箱(日本), EPICSXL型流式细胞仪(COULTER CO. U.S.A)。

　1.2  方法

　　1.2.1  细胞培养  组织来源于手术切除的新鲜标本，取自青光眼小梁切除术后失败滤过泡行手术修复时切除下来的瘢痕组织4例，患者均为男性，年龄23～35岁。所有患者术前、术中均未接受抗瘢痕药物治疗。将切下来的瘢痕组织块置于培养皿内，用含双抗PBS漂洗2～3次，加入适量FCS，将组织剪成0.5～1　mm2大小组织块，将含组织块的FCS混合液，均匀覆盖于50mL培养瓶接种面，轻轻翻转培养瓶使组织贴壁面朝上。贴壁4h后加入含有双抗及10%FCS的DMEM培养液，置37 ℃，5%CO2培养箱内，每周换液2～3次,待细胞融合后，用0.125%的胰蛋白酶消化，以1∶2传代，取传至第4～9代的细胞进行实验。

　　1.2.2  FCM检测抗TGFβ2抗体对FB周期的影响    　　参考文献［3］略有改动。分别收集不同抗TGFβ2抗体浓度（0、0.01、0.1、1mg/L）以及半数抑制率IC50浓度作用不同时间（0、24、48、72h）的FB，调整其个数达1×109cells/L。加入冷PBS洗涤离心2次，70%冰乙醇4 ℃固定保存。次日弃去乙醇，PBS洗涤离心2次，留0.2mL PBS，将细胞轻轻吹打成单细胞悬液，加入PI染液（含PI 50mg/L、Rnase100 g/L、TritonX100 0.1%、柠檬酸钠1g/L、0.9%NS）4 ℃避光染色30min，经200目尼龙网过滤后，用FCM在氩激光光源、激发波长为488nm、变异系数小于2％条件下检测细胞核中PI荧光强度，并用联机专用软件处理数据，计算出各时相细胞比例。    　　　1.3  统计学处理    　　采用SPSS 11.0统计软件，计量资料用±s表示，多个样本均数的比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。    　　2  结果    　　2.1  滤过泡瘢痕FB的培养结果    　　正常存活的FB生长增殖旺盛，呈旋涡状密集，平行极性排列，互相连接成片，清晰。细胞呈梭形，形态规则，胞体饱满，有2～3个扁平而长的突起相联系。胞核较大、呈卵圆形，染色质结构疏松（图1）。实验剂量范围内的抗体对FB的生长具有明显抑制作用，且随抗体浓度增加、作用时间延长，活细胞数量逐渐减少，细胞间隔增宽，细胞突起明显缩短，甚或消失。细胞变圆，胞体缩小，细胞质减少，有的呈空泡状，染色质浓缩边聚，胞核模糊或断裂成块状（图2）。      　　图1  传代培养7d的FB     （正常对照40×）（略）                                      

　　图2  0. 1 μg/mL抗TGFβ2抗体作用24h的FB (40×)（略）     　　2.2  抗TGFβ2抗体剂量依赖性降低FB增殖指数       用0.01～1mg/L抗TGFβ2抗体处理细胞24h，结果显示，随着抗TGFβ2抗体浓度增大，FBG1期细胞百分数增多，而S、G2期的细胞含量逐渐减少。计算增殖指数PI=（S+G2）/（G1+S+G2），可见随着抗体浓度增大时FB增殖指数呈下降趋势（表1、图3～5）。高浓度组可见明显的亚二倍体凋亡峰，凋亡率为(9.8+1.3)%。

　　2.3  抗TGFβ2抗体时间依赖性降低FB增殖指数    　　用0.14　mg/L抗TGFβ2抗体分别作用于FB 0、24、48、72h，结果显示，随着抗TGFβ2抗体作用时间的延长，G1期细胞百分数增多，而S、G2期的细胞含量逐渐减少，FB增殖指数呈下降趋势（P<0.05）（表2，图6、7）。    　　表1  不同浓度抗TGFβ2抗体对FB周期的影响（略）

与对照比较，*P＜0.05。

　　图3  正常对照组流式细胞图（略）               

　　图4  0.1mg/L抗TGFβ2抗体作用24h（略）     　　图5  1mg/L抗TGFβ2抗体作用24h （略）              

　　图6  0.14 mg/L抗TGFβ2抗体作用４８h（略）     　　图7  0.14 mg/L抗TGFβ2抗体作用72 h（略）     　　表2  抗TGFβ2抗体不同作用时间对FB周期的影响（略）

　　与对照比较，*P＜0.05。    　　3  讨论                            　　青光眼滤过性手术后瘢痕的过度增殖是降低手术成功率的主要因素［4］，临床应用上一些抗瘢痕药物，如抗丝裂霉素C和5氟脲嘧啶等虽然可通过引起FB广泛的坏死和凋亡［5］而阻止手术瘢痕的过度增殖、改善手术后滤过泡的功能和提高手术成功率，但也可产生副作用和严重并发症，因此其临床应用受到限制［6］。    　　研究显示，TGFβ是诱导结膜囊FB合成其自身的主要诱导因子，其中TGFβ2占主导地位，人眼结膜囊FB可以通过旁分泌和（或）自分泌TGFβ2影响结膜滤过泡的愈合过程；房水中TGFβ2的含量也影响手术后青光眼滤过泡的愈合过程［7］。近年来研究表明，TGFβ多克隆抗体具有抗皮肤瘢痕增殖的作用，但不适用于人眼的研究。而抗TGFβ2抗体是一种新型的重组人抗TGFβ2单克隆抗体，它不同于其他TGFβ抗体是由于它具有人的基因序列、高亲和力及特异性作用于TGFβ2等特点，而且不影响人眼的正常免疫过程。在动物实验过程中，抗TGFβ2抗体没有出现像抗代谢药物MMC那样严重的并发症，对周围组织也没有明显的破坏作用，组织耐受性好［8］。    　　我们研究发现，在体外培养的瘢痕FB中加入含有抗TGFβ2抗体的培养液后，随着药物浓度增加、作用时间延长，活细胞数量逐渐减少，细胞间隔增宽，失去联系；胞膜皱缩，胞体缩小，细胞质减少，有的呈空泡状；染色质浓缩边聚，或断裂成块状。说明实验剂量范围内的抗体对FB的生长具有明显抑制作用，且随抗体浓度增加、作用时间延长抑制更明显。    　　细胞周期的分布可以直观地反映细胞群体的增殖状况,G1期是决定细胞增殖状态的关键阶段，也决定了细胞周期的长短。瘢痕FB属于增殖旺盛的细胞，其G1期持续时间短，而处于S、G2期的细胞比例高，存在活跃的DNA合成［9］。FCM是一项新的细胞学检测技术，能快速、准确地研究任何类型细胞的周期分布规律，因此，我们利用FCM来检测抗TGFβ2抗体对FB的细胞周期的影响。检测结果表明，随着抗TGFβ2抗体剂量增加及作用时间的延长，G1期细胞数量增多，S和G2期细胞含量逐渐减少（P<0.01），FB增殖指数呈下降趋势（P<0.05），说明抗TGFβ2抗体能阻断FB从G1进入S期，使细胞停滞在G1期，并在抗TGFβ2抗体高浓度组可见明显的亚二倍体凋亡峰，凋亡率为(9.8+1.3)%。由此可见，抗TGFβ2抗体可时间、剂量依赖性降低FB增殖指数并能诱导FB发生凋亡，从而抑制了FB的生长增殖，而抗TGFβ2抗体引起凋亡的作用机制尚需进一步研究。    　　本文结果显示抗TGFβ2抗体对FB生长周期有影响，抑制了细胞的增殖，这为将来在临床治疗青光眼手术后滤过泡瘢痕的可行性提供进一步的实验依据。 

【参考文献】  　　［1］ 杨力，郭树忠.成纤维细胞与创伤修复的生物学行为［J］.中国临床康复，2002, 6(3): 470471.

［2］ Kottler R U, Junemann A G, Aigner Y, et al. Comparative effect of TGF beta1,beta2, andbeta3 on extracellular matrix production, proliferation, migration, and collagen contraction of human Tenon's capsule fibroblasts in pseudoexfoliation and primary openangle glaucoma ［J］. Exp Eye Res, 2005, 80(2):121134.

　　［3］ 彭俊华，张峰，张华欣，等. 辛基酚对MDAMB231乳腺癌细胞周期及周期蛋白表达的影响［J］. 第四军医大学学报，2006, 27 (24): 22392241.

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　　［8］ Siriwardene D, Khaw P T, King A J, et al. Human antiTransforming growth factorbata2 monoclonal antibody: a new modulator of wound healing in trabeculectomy［J］. Ophthalmology, 2002, 109(6): 427430.

　　［9］ Disalvo C V, Zhang D, Jacobberger J W. Regulation of NIH3T3 cell G1 phase transit by serum during exponential growth［J］. Cells Prolif, 1995, 28(6): 511524.