活化T细胞核因子非编码基因对人脐静脉内皮细胞调节作用的实验研究

活化T细胞核因子的非编码基因.是活化T细胞核因子(nuclearfactorofactivatedcells)的一个非编码阻抑物,有研究证实NEAT信号通路在心脏、维竹结构、肌肉结构和神经组织发育中起关键作用哈佛医学院研究表明介导血管内皮生长因子(Vascularendothelialgroivhfactor,VECF)诱导的人脐静!永内皮细胞(humanumbilical}-cinendothelialcell.,HL{VEC)增殖,而NP}0-在H[\E(中过过表达可阻抑NF_1T转运至细饱核二而管内皮细胞分泌多种调节皿管功能的;舌件物质.与心血管疾病密切相关3最近已有研究试图通过}几预治疗以恢复某些心血管疾病患者的内皮功能,改善预后",这是心血管疾病治疗方法的新探索NRUN基因对HtVEC:功能有何具沐影啊目前尚米见报道_本研究通过PCR法获得\R(>N基因,同时得到damon}t'illingham实验室惠赠其在《Jcience》周刊中报道的对!VRU\基因有干扰作用的短发夹RNhRN.同细胞株进行基础实验,研究了NBUN基囚对11L}EC基木特性的调节作用.    材料与方法    1.主要材料和i},}i1:HUV'EC细胞购自Caml}re公司(美国)293T细胞及其配套培养基Dl-TEIll,RPi111640及FBS购自Camhrer公司(美国)促转染效率试剂购自Sigma公司(美国)转染试剂及T4连接酶及配套缓冲液购自Roche公司(瑞士)胞浆荧光标记物购自Calbiochcm公司(美国)超氧化物阴离子荧光探针购自vlolecularProh、公司(美国)liN;提取试剂盒购自}mlrion公司(美国)cI>N1合成试剂盒及实时定量PCR棍合液购自Bio-Rad公司(美国)基底膜基质购自BD公司(美国)胶回收试剂盒及提质粒试剂盒购自(i)r}GF}公司(德国)_核酸外切酶购自NeeEnglandRiolal〕公司(美国),单溶液细胞增殖分析试剂购自Pron}P}a公司(美国)实时定量PCI}仪购日1ii〔公司(美国)核酸紫外分析仪购白Recl<man公司(美国)二电泳仪购日Pharmacia公司(美国)_光学显微镜购自Ol}Tmpu*公司(美国)数码凝胶图像定位分析系统购自Kodak公司(美I+I).    2.vric)v全长基因的获取:人的9号染色体(E\L>1\I}};:}0006443:个长210636hp,NR()\丛因位尹共第99233一101962个碱毕,基因全长27001y.二获取全长基因PCR引物为}_游:5’一(}T(}G.}TCCC-1C.1TCT(;'I-}ATGT}A_}C};}CCC.}1G(:1:}GG(;}W:'I'_}(;T}CC-3',下游:5'-CGG}ATTCCC"1'C}:}C10LC-1C}TC.CC}CTGGCTG-3‘反应条件为940C1min.}6一(_4}x.72`C3min30、3}个循f}、将P(;R护物琼脂糖电泳,井用数码凝胶图像定位分析系统拍照,切取2700帅附近的条带胶纯化,)}丁核酸紫外分析仪测浓度最后测序,用RLAS1'比对序列,确定其是否为NR01\基因.    3.NRON基囚连接至pRahe-retro-puro载体:于37℃用RamHI和};coRI双酶切载体和1RO1V基因PCR产物各1.5h,酶切后在100V的0.87}琼脂糖凝胶中电泳45min,切取27001>p附一近的条带井纯化_用T4连接酶在室温连接NR(>N基囚和载体1h习冬连接产物与解冻感受态细胞DH10在冰上混和20min,迅速放入420C水浴锅中热击40*,在冰_I_放置2min,然后与预热的}()C混匀将混和液置于37℃的培养箱中以150转/min培养45min,全部涂在预热的含氨节抗性的LB平板上,置37℃温箱培养过夜用灭菌牙签挑取单菌落放人含氨节抗生素的2mlLB液体培养基中,37℃,220转/min培养12h,提取质粒,然后用BamHI和EcoRI双酶切鉴定并测序.    4.NRO-V的5个不l司*hB}A由}arron}1illingham实验室惠赠)连接至pSul>er-ret,载体:shRN各序列已插人pCVI,-sit载体2.该载体内含shRN编码质粒,当转染进细胞后促进hlV干扰,使口标基囚1R01}表达失活将5个和载体相连的shR\_}分}J}J与解冻的感受态细胞I>H10在冰上混和20min,迅速放人420C水浴锅中热击40s.在冰l_放置2Tllln,然后与预热的}(>C混匀将混和液置于370C的培养箱中以150转/min培养45min,个部涂在预热的含卜那抗性的T,B平板上,置370C温箱培养过夜灭菌才签挑取单菌落放入含卡那霉素的2nllLB液体培养基中,37℃,220转/min培养12h,试剂盒提取质粒.    5.稳定细胞系的建立:将2931'细胞培养在含TO}/小牛血清(FBS)的I)}1I;1\1培养液中.在转染IJ勺前1d接种1.5x10`个细饱至10的结养坦1中转染步骤:加预热470闪TV1FV1至}.5ml离心管中(小含FB5和抗生索),将30闪H'u(}ENE6加人该离心管中,轻微震荡离心管使两种液体混匀,此为混和液L,室温反应5min,将转染所需3种I>\混和(按每个1.5ml离心管算.其中逆转录病毒质粒Per;PHlll含送转录病毒包装质粒RDF(含RD114)2.5N-r,i,Rar,}w或hP,}a的载体及空载体pT3ahe-retro-puro和pSuper-retro-puro各3.75}g,此为混和液2-将混和液!逐滴加人各不同棍和液2中,此为混和液3,室温反应15min,将各不l司混}II液3分j}IJ逐滴加人培养有297T细胞的10cm培养IIII_中将转染后的细胞放人37℃培养箱中培养48h后,收集上清液,用0.45}n,孔径的过滤器过滤后分装至冻存管中,冻存于一80℃冰箱在6孔板中培养HLVE(;至协孔1.0x106个细胞,去培养液后在每孔中加人!ml逆转录病毒,l司时添力f(r}l凝聚胺(hol}rl>rene)增)J1I转染效率_81:后十每孔加人完全培养基过夜第2天换成新鲜的完全培养液第3天添加0.3}}}嗓吟霉素进行筛选,2d后换成添加0.5嚓岭露素的完全培养基因.    6.稳定细胞系的检测:筛选后得4个稳定细胞系,即NR01过表达细胞系、ph.}BE空载体细胞系、hRV十扰细胞系和pSup二空载体细胞系,均表达于HUVEC分别十6孔板培养该4种稳定细胞系,提取各细胞系的总RN:}后用核酸紫外分析仪测浓度,反转录成〔.D\_}二RT-PCPL检测\RU1?基因的表达水平,95℃变性3min,950C20a,40个循环,最后反应1minRT-PCR引物:(1)NROV引物,}:游_5'-CCA(}.AGCCATA,}TT}GAGC1}.}C-3',下游5'-_}}:AGG_}GC}GT}CTGG}A_}C-}C-3',.(2)内参引物序列(}}PDH;(n1CBIGeneID}2597)上游5'-CGAC_1C1'CAGCC(}C}TCTTC-3',下游3'-CGCCCA}T_}1C:(}_}CC}:1:ATCCG-5’每个样品按相同条件重复3次与内参基因G:}PDH均一化消除实验误差后取平均值.    7.非放射性细胞增殖分析(}TTS):分析相同处理(48h),不同FBS浓度(1%,20}c,4%,8%禾f1107c)的培养液对各稳定细胞系细胞生长的影响将4种稳定表达细胞系分别培养十96孔平板中,培养液为含10热灭活I'BS的IJB1}T-2,第2天换成含0.5n}FBs的IJBM-2饥饿培养8h二然后用含不同浓度的FBS(1%,2%,4%,8%和10c7e)的EBM-2培养;{妞音养48h,后弃培养液将单溶液细胞增殖分析试剂与禽0.5}}}FBA的F.BVI-2培养液以1:500的比例混和分别力}I人各96孔中锡纸包裹避光,放人37℃培养箱中反应30min后在酶联免疫检测仪上读取数据每个样品读取3次,取平均值.    8.内皮成管实验:基底膜基质融解后呈胶冻状.释轻扦匀后用枪头吸取250闪均匀铺在24孔阪的行个孔将铺好的荃底膜基质置于370C培养箱中30min,待基底膜基质凝固后取出不同细胞系根据实验需求经不同处理后,饥饿8h,消化并悬浮于培养液中将悬浮细胞分别接种于凝固的基底膜基质上,每个孔接种1.0x10'个细胞,置于37℃培养箱中培养3一8h,期问每隔2h在光学显微镜下观察细胞成管状况并拍照.    9.血管内皮细胞迁移实验:将不同细胞系按实验要求处理后饥饿8h.T;I>T_}消化并悬浮于培养液中,所用的Transwell小室滤膜为8O,m孔径的聚碳酸脂微孔滤膜把滤膜置于24板的每个孔,在上室加人250闪细胞悬液,在下室加入750ml含3%LB`的FBM-2培养基将24孔板置于370C培养箱中培养22一24卜在12.5ml预热HBSS缓冲液中加入20闪Calcein}D1荧光探针,混匀.将滤膜转至新的24孔板中,在每个孔中加500一600闪含Caleein_A1V1的HBSS缓冲液,于37℃培养箱中培养90n}in酶联免疫检测仪读取被标记仁荧光的细胞数口_每个孔重复读取4次,取平均值.    10.统计学方法:计量资料以无土、表示多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用t检验,数据相关性采用线性相关分析_以f'<0'.O5为差异有统计学意义.    结果    1.NR01全长基因的获取检测结果:获得NROI\全长基因PCR产物,基因、为2700hla上游测序结果BL:}ST比对:>giI4204325IgbIAC006443.1IAG006443HomoSapienschromO5ome9,clonehRPK.494_N_15,completesequenceLength=210636,Sco,1092bits(551),E}l}ect=0.0,Identities=561/563(99%),Gaps=1/563(0%)下游测序结果BLAST比对:>g}14204325gbIAC006443.1IAC006443HomosapienchromO5ome9,clonehRPK.494_}1_15,completesequence,Length=210636.wore(560),Expect=0.0,Identities=562/563(99r/c),Gaps=0/563(0%)一由PCR产物序列与BLAST比对可知,PCR产物为全长\RON基因.    2.稳定细胞系检测结果:B'1'-1'C;PL结果显T.基因在\ROV过表达细胞系中的表达(138.00x10-士8.54x10)显著高于正常HLVFC细胞系(2.58x10-310.10x10P<0.O1)和pBabe空载体细胞系(1.90x10-'士0.2810-',P<0.01);在}hRN干扰细胞系中的表达(0.41x10-3士0.02x10-3)显著低于正常HLVEC细胞系(2.24x10-3士0.22x10-},P<0.05)和}}Supe,空载体细胞系(1.88x10-3士0.09x10-',P<0.05),正常HLV'EC细胞系与pBabe空载体细胞系,ahRN:}空载体细胞系之间差异无统计学意义3.>\1'1S分析结果:处理后48h,细胞生长均与培养液中的FBS浓度呈正相关(正常HLVEC细胞系r二0.91,pB-CBE空载体细胞系r=0.88,'}\RON过表达细胞系r二0.89,pSupe:空载体细胞系r=0.95,*hR'V}仁扰细胞系r=0.97)NRON过表达细胞系在各个FBS浓度下细胞增值能力均弱于正常HIVEC细胞系和pBABE空载体细胞系(P均<0.05,;;=3),正常HUVEC细胞系与邓\L1E空载体细胞系比较差异无统计学意义‘表1扰细饱系在FBS浓度为4rh,8rlr和10}.时细胞增殖能力均高于相应的正常HLV'EC细胞系和pSuper空载体细胞系(P均<0.05),其余浓度差异则无统计一学意义,正常HUVEC细胞系与r:>S}}he}}空载体细胞系比较差异尤统计学意义(表2).    4.内支成管实验丰洲则结果(图2):由于外源载体的插/、.细饱的成管能力受到影啊}>B}#iE,空载体细胞系和}>}uye「空载体细胞系的成管数量少于正常HUVEC细胞系1}R01}过表达细胞系的成管数量_(8.33士0.12条」明显少于正常HUBEC细胞系[(23.33士3.O1)条,P<0.0_5,n=3」和pBCBE空载体细胞系〔(19.67士1.42)条,P<O.O5,n-3」ahRV}弓几扰细胞系的成管数量[(36.0010.51)条明显多于正常HUV'EC细胞系(P<0.05.,,=3)和pSuper空载体细胞系[(17.33士2.93)条,P<().05,Il=3],止常HI一VEC细胞系与pBebe空载体细胞系,}hR\A空载休细胞系之间比较差异无统汁学意义5.血管内皮细胞迁移实验检测结果(图3,4).表达细胞系细胞迁移数[(1857士h5)个_明显低于正J常HUVEC细胞系_(514>士7})个_和pBCBE空载体细胞系_(4411士}17个.P均<0.01,rr=3},正常HL}E(:细咆系与}>Bal>},空载体系比较差异无统计学意义shh1V}}扰细胞系细胞迁移数[(6987士50个」明显高于正常HL}EC细胞系[(5145士72)个_和pSupen空载体细胞系[(38831109>个T'均<0.O1,,,=3,正常HUVEC与}O5upr,空载体细饱系比较差异无统计学意义.    讨论    近年来非编码P.\逐渐成为研究热点,它们在基因沉默及改变大区域染色体中的染色质结构等方面都起着重要的作用,6二长期以来,研究者一直比较关注与心血管疾病相关的非编码RN:我们在杳阅文南勺时压意到!,science》于?005年9月刊登了入.二,m\\-illin沙am等的研究成果,他们通过寻找进化保守,发展J一个识}qI}功能非编码R1}:的方法—用大批基于细胞的、hRNA,对假定的非编码R\'进行于扰,使其转录功能失活,从而导致相关基因显著激活进一步研究NRON基因,发现其是转录因子NF}T的一个阻抑物’k哈佛医学院研究指出听有已知的vF}T蛋自活性均依赖于胞浆中钙离子转运至细胞核内的流量X006年圣地亚哥个球心血管年会上,他们宣布其研究结果aRC:>x在HL-}>}:C中讨量表扒可阴抑NEAT转运至细胞核,使NF失去转录血管生成相关基因的活性并抑制而管内皮细胞的基本特性内皮细胞除完成血液和组织液的代谢交换以外,还可产生和分泌10余种生物活性物质,具有维持正常泊!_管张力、血液正常状态和动态平衡等作用,并通过其屏障和分泌功能,影响着炎症反应的发生、发展,参与调节机体的免疫应答一内皮细胞功能紊乱在高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化等心血管疾病的发病过程中具有重要意义因此通过非编码RN4调节内皮功能,从而研究预防、治疗心血管疾病具有相当广泛的前景本研究证实了基因在被NRON基因抑制或者激活后,能显著影响血管内皮细胞的基本特性(图5),不但对NRON基因的进一步研究打下基础,更对研究非编码RBA调节内皮功能,预防、治疗心血管疾病具有指导意义.    参考文献    Willingham AT,Orth AP,Batalov S. A strategy for probing the function of noncoding RNAs finds arepressor of NFAT[J].Science,2005.1570-1573.    Johnson EN,Lee YM,Sander TL. NFATcl mediates vascular endothelial growth factor-induced proliferation of human pulmonary valve endothelial cells[J].Journal of Biological Chemistry,2003.1686-1692.    曾正陪. 血管内皮的内分泌功能[J].中华内科杂志,1998,(2):77-78.doi:10.3760/j.issn:0578-1426.1998.02.002.    刘群峰,马虹. 血管内皮细胞与心血管疾病的关系及其研究进展[J].心脏杂志,2002.126-128.    Gerstein MB,Bruce C,Rozowsky JS. What is a gene,postENCODE? History and updated definition[J].Genome Research,.    Mattick JS,Taft RJ,Faulkner GJ. A global view of genomic information-moving beyond the gene and the master regulator[J].Trends in Genetics,.    Okazaki Y,Furuno M,Kasukawa T. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs[J].Nature,2002.563-573.    Numata K,Kanai A,Saito R. Identification of putative noncoding RNAs among the RIKEN mouse full-length cDNA collection[J].Genome Research,2003.1301-1306.