白藜芦醇对氧诱导鼠视网膜B细胞白血病蛋白2和血管内皮生长因子表达的影响

　　作者：李雯霖，肖诗艺，王莉，刘喜花，何莉，王秀芝，张莉 作者单位：广东省深圳市儿童医院 眼科，广东 深圳 518026

　　【摘要】 目的 探讨白藜芦醇对高氧诱导的早产儿视网膜病变新生鼠视网膜B细胞白血病蛋白2(B-cell leukemia/lymphoma-2，bcl-2)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的影响。方法 选取鼠龄为7 d的Sprague-Dawley(SD)幼鼠60只，分A组(正常对照组)、B组(给氧组)和C(实验组1)、D(实验组2)、E(实验组3)三个实验组，每组12只。A组幼鼠生活在正常氧环境中，B组、C组、D组和E组幼鼠置于氧分压为(75±2)%的氧环境中连续生活5 d，建立高氧诱导的早产儿视网膜病变动物模型。C、D、E三个实验组分别予白藜芦醇10 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)、60 mg/(kg·d)灌胃给药，每天一次，连续5 d，所有幼鼠均于17 d鼠龄处死。应用Western-blot 免疫印迹法分析检测鼠视网膜bcl-2的表达，并以计算机图像分析仪进行分析;用ELISA方法检测鼠视网膜VEGF的表达。结果 与A组(正常对照组)比较，B组(给氧组)视网膜bcl-2和VEGF的表达是A组的4倍，两组差异有统计学意义(P<0.01);与B组比较，C、D、E三个实验组视网膜bcl-2和VEGF的表达逐渐减弱，呈剂量依赖关系，不同浓度的白藜芦醇实验组之间存在显著性的差异(P<0.01)，三种不同浓度(10 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg)的白藜芦醇均显著抑制视网膜bcl-2和VEGF的表达，其抑制率分别为11.09%、38.05%、69.76%和3.42%、23.04%、43.69%。结论 白藜芦醇可显著抑制高氧诱导的早产儿视网膜病变新生鼠视网膜bcl-2和VEGF表达，可能对早产儿视网膜病变等视网膜新生血管疾病具有治疗作用。

　　【关键词】 白藜芦醇;早产儿视网膜病变;B细胞白血病蛋白2;血管内皮生长因子

　　Effect of resveratrol on the expression of bcl-2 and VEGF in oxygen-induced retinopathy of prematurity in rats

　　LI Wenlin， XIAO Shiyi， WANG Li， et al.

　　Department of Ophthalmology， Shenzhen Children’s Hospital， Shenzhen China， 518026

　　[Abstract] Objective To explore the inhibitory effect of resveratrol on the expression of bcl-2(B-cell leukemia/lymphoma-2) and VEGF(vascular endothelial growth factor) in an animal model of oxygen-induced retinopathy of prematurity. Methods Sixty 7-day-old Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups： group A (normal control group)， group B (oxygen-induced group) and three resveratrol-treated groups (group C， group D and group E). Each group consisted of 12 rats. The rats in group A lived in a normal oxygen environment; the rats in the other groups were placed in an environment with (75±2)% oxygen for 5 days to establish an animal model of oxygen-induced retinopathy of prematurity. The respective doses of resveratrol were given to the three resveratrol-treated groups (10 mg/kg， 30 mg/kg and 60 mg/kg) by gastric gavage once a day for 5 days. All rats were sacrificed on the seventeenth day. Western-blot analysis was performed to detect the effect of resveratrol on the expression of bcl-2 in the retinas， and the picture was analyzed with a computer image analysis meter. ELISA was performed to detect the expression of VEGF in the retinas. Results Compared to group A (normal control group)， the expression of bcl-2 and VEGF in the retinas in group B (oxygen-induced group) was strong with a 4-fold increase and the difference was statistically significant (P<0.01). Compared to group B (oxygen-induced group)， the expression of bcl-2 and VEGF in the retinas in the three resveratrol-treated groups gradually decreased， showing a dose-dependent effect. The effects of different concentrations of resveratrol at 10 mg/kg， 30 mg/kg and 60 mg/kg were statistically significant (P<0.01). The expression of bcl-2 decreased 11.09%， 38.05%， and 69.76% and the expression of VEGF decreased 3.42%， 23.04% and 43.69% in response to the respective doses of resveratrol. Conclusion Resveratrol can significantly inhibit the expression of bcl-2 and VEGF in an animal model of oxygen-induced retinopathy of prematurity， which may provide a new approach for the prevention and treatment of retinal neovascular diseases such as retinopathy of prematurity.

　　[Key words] resveratrol; retinopathy of prematurity; B-cell leukemia/lymphoma-2; vascular endothelial growth factor

　　随着新生儿医学的发展，早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)的发病率有显著增加的趋势。近年来尽管在诊断和治疗上有明显进步，但ROP已成为世界范围内重要致盲眼病之一[1-3]。为从根本上治愈ROP，减少ROP的发生，揭示ROP的发生机制、寻找早期防治ROP的有效药物已成为目前迫切需要解决的问题。氧诱导视网膜病变鼠模型是ROP和其他异常视网膜血管增生性疾病的主要模型之一。白藜芦醇是一类主要存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中的多酚类化和物，目前已证明白藜芦醇具备抗血小板聚集、清除自由基、抗氧化、抗细胞凋亡、保护心血管等多种生物学作用[4-5]。本研究拟通过动物实验，观察白藜芦醇对氧诱导鼠视网膜B细胞白血病蛋白2(B-cell leukemia/lymphoma-2，bcl-2)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的影响，旨在探索白藜芦醇对ROP视网膜新生血管形成的影响作用及可能机制，从而为早期防治ROP开辟新的治疗途径。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要仪器与试剂 电泳仪(BIO-RAD，USA)，微量高速制冷离心机(Beckman，USA)，超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，恒温水浴箱，电动摇床，台式多用恒温振荡器THZ-88-1型(江苏青太包鹿河化仪器)，紫外分光光度计(Beckman，USA)。Western blot试剂盒(晶美生物公司)和VEGF(晶美生物公司)，白藜芦醇(中国药品生物制品检定所提供的标准品，纯度大于99%)。

　　1.2 动物模型制备及分组 研究采用新生Sprague-Dawley(SD) 鼠60只，分A组(正常对照组)、B组(给氧组)和C(实验组1)、D(实验组2)、E(实验组3)三个实验组，每组12只。A组(正常对照组)幼鼠生活在正常氧环境中。将B、C、D、E组幼鼠于生后7 d与同笼的2只母鼠一起装入有机玻璃制作的密闭氧箱饲氧，一端设计为进气孔，另一端设计为出气孔，先将玻璃容器内气体抽出成为真空状态，然后接入100%湿润医用纯氧气，氧气流量控制在1.5 L/min，使容器内氧分压保持为(75±2)%，期间用氧浓度测氧仪监测容器内的氧分压，控制室温在(23±2)℃，日光照明，每两天打开玻璃容器更换垫料，加食、换水，替换母鼠。在此高氧环境中饲养5 d(即出生后第12天)，然后返回正常空气环境中饲养5 d(即出生第17天)，使幼鼠处于相对低氧状态下，建立ROP视网膜新生血管动物模型。其中B组出氧箱后不作任何处理;C、D、E三个实验组分别予白藜芦醇10 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)、60 mg/(kg·d)灌胃给药，每天一次，连续5 d，所有幼鼠均于第17天处死。

　　1.3 氧诱导鼠视网膜bcl-2检测(Western blot) 每组随机取4只鼠(8只眼球)，在显微镜下分离视网膜。将视网膜组织混合并置于5倍体积A 缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂cocktail。

　　在细胞裂解仪上裂解视网膜组织。将裂解液低温高速离心(4℃，12 000 r/min)15 min去除上清液，取2倍体积B缓冲液与沉淀物混合，4℃环境下作用30 min，低温高速离心(4℃，15 000 r/min)20 min。弃核碎片，以小牛血清白蛋白为标准，用紫外分光仪定量检测上清液的核蛋白含量。核蛋白液分装，于-70℃保存。将提取的核蛋白液，用Bradford法测定样本蛋白质浓度，制胶，在积存胶加样孔内加入等量蛋白质样本和标志物(marker)电泳，而后转移到硝酸纤维素膜上。用封闭液(5%脱脂奶粉、10 mmol/LTris、100 mmol/L氯化钠、0.1%Tween 20，pH值为7.5)37℃封闭1 h后再与1∶500鼠抗人bcl-2单克隆抗体4℃一起孵育过夜。充分洗涤后与二抗1∶500辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG室温下孵育1 h。DAB染色，拍照，再用凝胶图像分析系统分析，蛋白含量以面积×密度表示，以对照组测得值定为100计算相对光密度值。

　　1.4 氧诱导鼠视网膜VEGF检测(ELISA) 每组随机取4只鼠8只眼球，在显微镜下分离视网膜。将视网膜置400 ?滋L全蛋白裂解液中，并加入蛋白酶抑制剂，置细胞裂解仪上裂解视网膜组织。将裂解液低温高速离心(4℃，12 000 r/min)15 min去除沉淀物，以小牛血清白蛋白为标准，用紫外分光仪定量检测上清液的蛋白含量。上清液分装，于-20℃保存待用。上清液用双抗体夹心法(ELISA试剂盒)检测视网膜全蛋白液中VEGF的水平。操作按试剂盒说明书，每个标本行双复孔检测。

　　1.5 统计学分析 所有数据均用SPSS 15.0软件进行统计分析。数据以平均值±标准差(x±s)表示，进行t检验和方差分析(LSD法和q检验)。按如下公式计算不同浓度药物的抑制率，抑制率(%)=(1-实验组A均数/对照组A均数)×100%。

　　2 结果

　　2.1 氧诱导鼠视网膜bcl-2的表达 经Western-blot检测发现，给氧组和三个不同浓度的白藜芦醇实验组在相对分子质量约120 000处可见一组棕黄色条带，给氧组最为明显，随着白藜芦醇浓度的增高，条带逐渐变淡。见图1。

　　各组中视网膜bcl-2的吸光度值见表1。与正常对照组比较，给氧组中视网膜bcl-2的表达是它的4倍(P<0.01);与给氧组比较，三种不同浓度(10 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg)的白藜芦醇实验组其bcl-2的相对光密度值显著降低(P<0.01)，呈剂量依赖关系，不同浓度的白藜芦醇实验组之间存在显著性的差异(P<0.01)，10 mg/kg白藜芦醇组bcl-2的含量降低了11.09%，30 mg/kg白藜芦醇组bcl-2的含量降低了38.05%，60 mg/kg白藜芦醇组bcl-2的含量降低了69.76%。

　　2.2 氧诱导鼠视网膜VEGF的表达 各组中视网膜VEGF的表达见表1。与正常对照组比较，给氧组中视网膜VEGF的表达显著增加(P<0.01)，与给氧组比较，三种不同浓度(10 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg)的白藜芦醇对氧诱导鼠视网膜VEGF的表达具有不同程度的抑制作用(P<0.01)，呈剂量依赖关系，不同浓度的白藜芦醇实验组之间存在显著性的差异(P<0.01)，三种不同浓度(10 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg)的白藜芦醇均显著抑制视网膜VEGF的表达，其抑制率分别为3.42%、23.04%和43.69%(P<0.01)。

　　3 讨论

　　早产儿视网膜病变是指发生于早产儿的以视网膜血管异常增生为特征的视网膜血管疾病。视网膜缺氧是导致视网膜新生血管形成的关键。缺氧可诱导视网膜产生血管生成因子，进而刺激新生血管形成[6]。VEGF在血管生成的过程中起中心调控作用，是启动新生血管形成所必须的最重要、最有效的物质。早产儿生后因肺功能不成熟给予氧疗时，视网膜处于高氧阶段，VEGF表达减弱，新生血管发育停滞，当视网膜发育过程中出现相对缺氧时，VEGF表达显著增强，导致视网膜新生血管形成[7]。bcl-2(B-cell leukemia/lymphoma-2)是重要的抗凋亡蛋白，以其为肿瘤治疗靶标已有多年。新近研究表明bcl-2表达与肿瘤新生血管形成密切相关，bcl-2可通过调节内皮细胞存活及促进血管生成因子的分泌影响新生血管形成[8-10];VEGF是连接新生血管形成各个网络的枢纽，多种研究表明bcl-2与VEGF可以相互调节，促进新生血管形成[10-11]。

　　我们通过建立氧诱导早产儿视网膜病变的新生鼠模型，观察白藜芦醇对ROP新生鼠视网膜bcl-2和VEGF表达的影响。Western blot检测结果表明，三种不同浓度(10 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg)的白藜芦醇均显著抑制视网膜bcl-2的表达，其抑制率分别为11.09%、38.05%和69.76%;ELISA检测结果表明三种不同浓度(10 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg)的白藜芦醇对视网膜VEGF的表达有显著抑制作用，抑制率分别为3.42%、23.04%和43.69%。实验证明白藜芦醇对ROP新生鼠视网膜bcl-2和VEGF表达有显著抑制作用。有研究表明，白藜芦醇具备抗肿瘤、抗氧化、清除自由基、抗血小板聚集、抗细胞凋亡、保护心血管等多种生物学作用[4-5]。Burkitt等[12]的研究证实白藜芦醇的抗氧化作用强于维生素E;并能清除自由基，尤其是羟自由基，使DNA免受损伤。白藜芦醇还可通过抑制二硫化谷胱甘肽的形成，使谷胱甘肽处于还原状态，从而抑制羟自由基的形成[13]。白藜芦醇还能下调多种肿瘤细胞的bcl-2与 VEGF的表达[14-15]。我们由此推测白藜芦醇可能通过抑制视网膜bcl-2和VEGF的表达来抑制ROP视网膜新生血管的形成，白藜芦醇对ROP等视网膜新生血管疾病的治疗可能具有潜在的应用前景，为视网膜新生血管疾病的药物治疗提供了一个新的思路，但目前对其确切的作用机制还不明了，有待进一步探讨。

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