小鼠骨髓间充质干细胞亚群动员自身心肌干细胞修复心肌梗死的初步探讨

2003年,美同hna率先批准自体昆髓I-细胞弓洁用于治疗心肌梗死.随后世界各地均开展干班饱移植研究其中应最为广泛及成熟的是骨髓间充质干细胞!.Bl'}}C),口前我国已经开展应用B\I}(治疗咦、神经、血管、心脏等器官病变的川-究侧利用治疗日身免疫性疾病也已进人.用阶段但是.移植疗法虽有一定的厅双"'L=J人们的期望还是相去甚远.    汗多基础和临床研究表明十.W咆移悄能够修,}L损种J心肌,促进血管新生,缩小亡肌梗比间积.厂丈告七习]能,但不同研究机构对I)IVhI.最终能在多大it.I=夏}_改善心功能尚存争i义我们认为,可能是由于是一群多克隆的细饱群体,不同的克隆亚群一爹夏心肌损伤的能力不同寻找全}{更好的修复心肌损伤的亚群,成为了哑须解决日叮司艺}00}年,Torella等首先从小鼠心脏中分离'}-占I有的心肌干细胞,从而打破了人们一直以采:iU为L,'1}Q'i胞属于水件一细胞,不可再生的概念过一步开丫龙现通过其表而不同的分化抗原,可以分为6II'.6个细胞亚群均可同心肌细胞定同分化心肌十细胞来源于骨髓干细JJ刨也卞研北利川二几,的6种小鼠心肌干细胞亚群表血分化书正浮、钊mBl'1SC进行分选,得到4种小鼠IVIS(:}Ilr.君卜t,L,胞抗原一1(vC_}-1)-/(:1>45一/CD31一、、(入一!-(:1)=lj一/CD31-,sC}-1一/cn}s一/cr>m一和、(、一1-(:I>}一/c}I>31一细胞亚群分别经尾静脉注小鼠体内,以期找到修复心肌损伤的最佳细胞亚群.    材料与方法    1.实验动物:健康C:57BL/6小鼠2龄,体质量(35.213.3)山上海中国医学科学实验动物中心提供2007-000动物的喂养及观察均按照非临床研究管理规范(t-}1_I'执行.    2.主要试剂和仪器:C57BL/6小鼠B\l}t_培养基(低糖培养基,含10rh胎牛Ibl.清),购日美国C:OagenBioecience*公司小鼠B}TSC脂肪分化试}}l盒、骨及软骨分化试剂盒(美国CsanenBi}i}cimoe,公司)CI>}}、CD31、CD111,'}}IicroBeads(关国1}1i1temi公司)GL;}1}'Tn7心脏超声仪(美匡{(}L公司)小动物活体成像仪(美国,柯达公司).    3.小鼠BMSC的分离、培养及鉴定:全骨髓培养小鼠Rlls(咦酶消化传代至第3代l1寸采用CT)Illa的磁珠负选,去除造血}几祖细胞继续传代至第7代当细饱达到80}/c一90r/c融合时,用胰酶消化细胞将消化的细胞以重新种植于6孔板内,行孔2x10一个细饱并添加2ml的生长培养基7犯,5份(:()日勺条件下孵育细胞何3c1换液1次‘直至细胞达至}J1(}0}%融合_将每孔内的牛长培养fir,换为脂肪诱汁分化或洲诱导分化或软骨诱导分化的培林},r(2n11)采用油红()染色分析脂肪诱份,素红染色分析黔诱导分化,固定后石蜡切一只汗日辛蓝检测软骨诱导分化取生长至1'7泛1>\I}i二井X11抱融合达80%一90%时.用0.25r/r胰蛋日Tn,in.用血清终止消化吸管仔细吹打使之形人屯乙息液采用1500r/min离心5min弃L清川i.9厂{理欲水(}S)洗涤2次,以0.9}/r闪S重悬制J义1一;x1门‘盯县、液.将细胞昙、液分装至5支样品竹中f}.业二一;:色洲一致活细胞数,要求活细抱数>90铸管不诊歇'JIl/、:!1:100稀释的FTT(:-LAG,P}-L洲子同型-![-}..?PL一(I)29申抗5浏作!:}0稀释至100阔.:100一(CD445}l作1:20稀祥至,月FI'120稀释至100闪,7(下1全龙反应20min每管加人0.9rkW1ml一}:匀,X000r/min离心lOmin.洗去未标记的打〔阵力一再阳人0.9clc\5.0.5ml重新混悬细饱.}}i}1'`lI:袍仪检测细胞表面标志抗原CD44和成a-1的表达.    4.小鼠心肌梗死模型的建工:麻醉满意后于环状软沂下}一l个气管环间采用0.7Illt11小几静脉穿刺:于泣汁穿刺,才雨人气管插管,深度为1.5一2几认一插百与小动物呼吸机连接,潮气量0.8-0.9ml呼吸频率120次/min,呼吸比1:1_在左前I.胶下万1一2on、作一弧1以切口,前起胸胃左缘.叨口长约?.0w暴露第s--4肋骨由第3I)加司进人h咖控以肺动脉圆-fi与左心耳石缘之间交点和卜自尖的假想连线为小鼠冠状动脉前降支走行标志以sio缝线于左心以根部下方约1}2mn.处人针,进针深度约U.一1nun,宽约Imno,以肺动脉圆锹左缘出针缝扎的方同和左心耳的下缘平行结扎成功标志为左心室前壁及心尖周围心肌!'Il织运动减弱心电图出现明撇的`T段抬高、1I导联可见sT段抬高超过0.2mV.缝合肋骨,关闭肋间隙.术后小鼠腹腔内注人5万单位青霉素.    5.小鼠BMSC亚群的分选:采用6种小鼠心肌干细胞亚群表面分化抗原,利用流式细胞技术按照前述操作对小鼠BMSC进行筛查可得SSEA-1-PE(1.1%),islet-1-PE(0.8%),CD31-PC7(48.0%),CD45-PE(30.7%)和C-kit-FITC(1.6%).按CD31及CD45两个分化抗原的阴性及阳性检测结果,利用磁珠将BMSC分为4个亚群,分别为SCA-1十/CD45一/CD31’、SCA一1十/CD45一/CD31十、SC一I+/CD45十/CD31一和SCA-1'/CD45十/CD31十细胞亚群.    6.体内实验检测小鼠BMSC各亚群及未分选群修复心肌损伤的效果:将各细胞亚群及未分选细胞群采用细胞膜荧光探针DiR(DiR,碘化物)标记. 分别经尾静脉注入心肌梗死48h小鼠体内,各细胞群细胞量为10'个,每个细胞群3只小鼠,共15只.另有3只心肌梗死小鼠未注人干细胞,作为阴性对照.于注射前及注射后48h行心脏彩超,分别检测并计算其左心室收缩末期直径差值(}L}IDS1、左心室舒张末期直径差值(:}LVID<l)、左心室射}TL分数差值(OLVEF),短轴缩短率差值(}F}).并进行小动物成像检测心脏局部DiR荧光强度.    7.小鼠BMSC各亚群细胞及未分选群细胞修复心肌损伤的机制:将SC}1-1'/CD45-/CD31一、SCA一1十/CD45一/CD31十、SCA一1+/CD45十/CD31一、SCA-1十/CD45`/CD31‘细胞亚群及未分选细饱群分别经尾静脉注人心肌梗死后48h的小鼠体f.注入后48h:对梗死心肌行心脏原位C-kit免在组或乙学染色,检测各细胞亚群及未分选细胞群动员匕、叭十细胞的能力,实验重复3次,每次实验在x200倍镜下计数C-kit十细胞数3次二而后对各细胞亚群及未分选细胞群治疗后的梗死心肌行HE染色,检测梗死心肌细胞治疗后的病理改变.对注人个细胞群的小鼠梗死心肌行原位免疫组织化学染色,检测心肌特异性抗原连接蛋白(Cx43)、肌间线蛋白(Desmin)和肌钙蛋白T(cTnT).    8统计学分析:使用SPSS15.0软件进行统计分析.数据以x.士￡表示.各细胞亚群间比较采用单因素方差分析,两两比较采用BonferronipO5t-hoc检验.所有统计假设检验均为双侧的.以P<0.05为差异有统计学意义.    结果    1.小鼠BMSC向脂肪、骨及软骨诱导分化结果(图1):油红0染色可见BMSC细胞诱导分化出红色的脂肪样细胞.茜素红染色可见B1SC诱导分化出骨样细胞.固定石蜡切片采用阿利辛蓝染色,可见BMSC诱导分化出软骨样细胞.    2.小鼠BMSC流式细胞仪鉴定结果:超过90的小鼠BMSC表达CD29(表达率为98%),CD44(表达率为100%)和SCA-1表达率为99.}),但很少细胞表达CDllb(表达率为0.1%).    3.小鼠心肌梗死模型成功建立的心电图检测结果:造模小鼠心电图示11导联ST段明显抬高,幅度超过0.2mV,aVF,aVR导联ST段压低.心肌梗死模型建立成功共造模小鼠22只,死亡4只,成功18只4各细胞群注人心肌梗死小鼠舌对其心功能影啊的检测结果(表1);SCA-I一〔D}}-CD31十细胞亚群注入心肌梗死小鼠体内后}8h.其}L}`IDs,}L}一IDd均明显小于注人其余细胞二六及未分选细胞群的小鼠(P均<0.O5),而ALA-EF}u,FS则均高于注人其余细胞亚群及未分选范7小鼠(P均<0.O5)s.各细抱亚胜及未分中荧龙强夏最(Tn1一称SCA-1'/CD45十/CD31一细胞亚群后}}h鼠梗死心肌局部C-kit表达分别为111.0士14.9,128.6士巧.5,106.1士7.4和166.8士20.6均高于注射未分选细胞群的小鼠(92.8士11.2),P均<0.O5,其中注人SCA-1十/CD45十/CD31十细胞亚群小鼠心肌局部C-kit表达又高于注射其他细胞亚群小鼠的心肌局部表达(P<0.O5).    7.注人BMSC各细胞亚群、未分选细胞群与阴性对照小鼠心肌定向分化的比较结果(图3,4);HE染色可见正常心肌组织,心肌纤维连续,横纹清晰.而梗死心肌组织心肌断裂,心肌纤维横纹模糊消失,局部出现浓染的凋亡小体.在注人SC.}-1十/CD45十/CD31+细胞亚群小鼠的心肌组织中可见成团聚集的纤维样细胞,细胞形态似小鼠骨髓间充质样细胞对注射SCA-1十/CD45'/CD31+细胞亚群小鼠的心脏行原位免疫组织化学染色,可见小鼠骨髓间充质样细胞表达出心肌特异性抗原Cx4王Desmin和cTnT.    讨论    大量的BMSC修复心肌损伤的研究认为其确有 修复效果,但修复程度确尚存争议.我们认为这种争议的根本原因是由于BMSC为一类多克隆细胞群体,不同亚群修复心肌损伤能力不同根据心肌干细胞(CSC)的研究,采用CSC表面分化抗原筛查小鼠BMSC,最终以CD45,CD31为标准采用磁珠分选得到4组亚群细胞,即SCA-1+/CD}S一/CD31一、}CA一1十/CD45一/CD31+、SCA一1十/(`D-ls-'CD3l一、SCA-1`/CD45十/CD31十细胞亚群.    CD31为血小板内皮细胞乳附分子一1}PECAM-1主要是通过激活或抑制信号通路中的信号蛋自达到抑制细胞凋亡的目的,这些蛋白包括Akt,Bol-2,Bcl-X,caspasc,p38/JNK,MAPK及一些不明蛋白.    CD45分子在所有自细胞上都有表达,称为自细胞共同抗原(leukocytecommonantigen,LCD).由一类结构相似、分子量较大的跨膜蛋白组成,广泛存在于日细胞表面,其胞浆区段具有蛋白质酪氨酸磷酸酶的作用,能使底物P561ek和P59fvn上酪氨酸脱磷酸而激活,在细胞的信息传导中发挥重要作用(;D4}是细胞膜上信号传导的关键分子,在淋巴细}'J}J发育成熟、功能调节及信号传递中具右重要意义.<:D4的分布可作为某些T细胞亚群的分类标志本实验通过心脏彩超、小动物活体成像证实SCA-1十/CD45十/CD31一细胞亚群修复受损心机能力优于其他细胞亚群及未分选群细胞B}1}C为一多克隆细胞群体二而目前认为BMSC治疗心肌梗死主要是通过间充质十细胞(MSC)修复心肌、改善心功能,其可能机制包括:(1)移植的MSC可在体内演变为心肌样细胞,从而取代因各种原因而死亡的心肌细胞,从而恢复心功能二(2)MSC移植能促进心脏新生血管的形成丰6(3)MSC移植完成了"绷带"作用,保护和恢复细胞外基质的完整性缓解了心}lI扩大7-79一、(4)旁分泌作用V1SC移植后可分泌大量的炎性因子,其对自身心肌一「细胞起到激活.    从完成自身修复0,本实验通过检测心肌十细胞的标志性分子C-kit,证明Bi\-1S(:局部动员CS(:是修复损伤心肌、改善心功能的机制之一井发现SC,a-1'/CI>45十/CD31十细胞亚群注身J一治疗心肌梗死镜下可见成团聚集的纤维样细胞,细胞形态似小鼠骨髓间充质样细胞,并通过原位免疫组织化学法检测心肌特异性抗原Cx43,Desmin,c'1nT证实为心肌样细胞而宋雷等{"{和李红敏等12报道AMPK信号通路介导的内皮型一氧化氮活酶(eN(>S)活化后可以抑制BMSC凋亡,本实验小动物活体成像示注人SCA-1"/CD45十/CD31十细胞亚群小鼠心肌组织平均荧光强度高于其余亚群,是否此细胞亚群可以介导更多的ei}O5活化,值得进一步研究综上所述,本研究证实小鼠B}MC是一类多克隆群体,不同的克隆群体均可动员白身心肌十细胞修复,RVTSC修复受损心肌既有动员自身CSC参与(旁分泌)又有BMSC向心肌样细胞分化,且两者同时进行,从各细胞亚群动员自身CSC的程度可知各亚群细胞动员心肌干细胞的能力为SCA-1十/CD45'/CD31(:D45>s(:a一1一/(:D45一/CD31>SC1-1一/一/CD31一>sCA一1一/CD45'/CD31.    参考文献    Torella D,Indolfi C,Goldspink DF. 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