缬沙坦对糖尿病大鼠视网膜组织NFκB表达影响

　　作者：冀鹏飞,周占宇,李松涛,付浴东　　作者单位：青岛大学医学院附属医院眼科

　　【摘要】 　目的探讨缬沙坦对糖尿病大鼠视网膜组织核因子κB(NFκB)表达的影响。方法 将20只Wistar大鼠随机分为正常对照组、高糖诱导视网膜病变模型组、缬沙坦处理组和缓冲液处理组，每组5只大鼠。正常对照组和模型组不做处理,缬沙坦组给予缬沙坦40 mg/kg灌胃, 缓冲液组给予相同体积缓冲液灌胃，用免疫组织化学法检测视网膜组织中NFκB的表达水平。结果 正常对照组大鼠视网膜组织NFκB无阳性表达，模型组、缬沙坦组、缓冲液组NFκB表达水平均明显高于正常对照组(F=262.00，q=18.06～34.59，P<0.01);缬沙坦组NFκB表达水平较模型组明显降低(q=15.29，P<0.01)。结论 缬沙坦能降低大鼠视网膜组织中NFκB表达水平，对糖尿病大鼠视网膜病变具有保护作用。

　　【关键词】 缬沙坦;糖尿病视网膜病变;NFκB;细胞凋亡;大鼠

　　EFFECT OF VALSARTAN ON RETINA NFκB EXPRESSION IN DIABETIC RATS

　　JI PENGFEI, ZHOU ZHANYU, LI SONGTAO, et al

　　(Department of Ophthalmology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);

　　[ABSTRACT] Objective To observe the effect of Valsartan on NFκB expression in retina of diabetic rats. MethodsTwenty Wistar rats were equally randomized to four groups:control group,highglucoseinduced retinopathy (HGIR) group, buffer group and Valsartan group. The control group and HGIR group received no therapy. The mice in Valsartan group were given Valsartan (40 mg/kg) intragastrically. Those in buffer group were given the same volume of buffer as Valsartan group intragastrically. The expression of NFκB in retinal tissue was examined immunohistochemically. Results There was no expression of NFκB in normal retina tissue. The expression of NFκB in the other three groups was significantly higher than the control group (F=262.00;q=18.06-34.59;P<0.01), while the NFκB expression in Valsartan group was significantly lower than that of the HGIR group (q=15.29,P<0.01). Conclusion Valsartan provided potential protection against retinopathy in diabetic rats via reducing NFκB expression of retinal tissue.

　　[KEY WORDS] Valsartan; diabetic retinopathy; NFkappa B; apoptosis; rats

　　糖尿病视网膜病变(DR)是由于体内血糖过高而引起的视网膜的微血管病变，由于视网膜组织的低氧、新生血管的形成，最终导致视功能不可逆的损害。随着研究的不断深入，许多学者发现，核因子κB (NFκB)在许多低氧性视网膜疾病的发生、发展中起着重要作用[13]。NFκB是一种具有多向性调节作用的蛋白质因子，它广泛参与体内的炎症、免疫、细胞凋亡、肿瘤等疾病的发生发展过程。有研究结果显示，活性氧(ROS)是诱导NFκB表达的重要因素之一[4]。 缬沙坦为血管紧张素Ⅱ受体1(ATⅠ)拮抗剂，可竞争性拮抗血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)。有研究结果表明，AngⅡ通过激活ATⅠ引起 ROS生成增多[5]。本实验主要通过建立高糖诱导视网膜病变大鼠模型，观察缬沙坦对NFκB表达的影响，初步探讨该药对高糖模型大鼠视网膜是否有保护作用。现将结果报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　健康雄性Wistar大鼠20只(青岛大学医学院动物实验中心提供)，体质量为220～240 g，自由饮食,室温饲养。主要试剂与药物为兔抗大鼠NFκB免疫组织化学试剂盒(美国Santa Cruz公司提供)，缬沙坦(北京诺华公司产品)，链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司产品)，One Touch血糖仪(美国强生公司产品)。

　　1.2 糖尿病大鼠模型的建立及分组

　　将20只Wistar大鼠随机分为正常对照组、高糖诱导视网膜病变模型组、缬沙坦处理组和缓冲液处理组，每组5只大鼠。后3组大鼠于第4周末禁食12 h后一次性腹腔注射100 mg/kg的STZ (用新鲜配制的pH 值为4.4 的0.1 mol/L枸橼酸缓冲液配制),24～48 h后取尾血测血糖，血糖>16.65 mmol/L者为造模成功。成模后每周检测 1次体质量和饮水量,每月检测 1次血糖。正常对照组和模型组不予任何处理，缬沙坦组每日以缬沙坦40 mg/kg灌胃, 缓冲液组给予等容积的缓冲液灌胃。

　　1.3 取材与固定

　　于第12周以过量戊巴比妥钠麻醉处死大鼠,立即摘除双侧眼球固定，梯度乙醇脱水,剪开眼球壁,去除眼前节和玻璃体,以睫状后长动脉为参考将视网膜做放射状切开，二甲苯透明,浸蜡,包埋，将平行于视神经矢状轴且避开视盘周围的视网膜进行连续切片,厚度约4 μm，每个标本切10张切片，相邻2张切片间隔12 μm。

　　1.4 NFκB的免疫组化检测

　　组织切片脱蜡，水化，冲洗，H2O2灭活内源性过氧化物酶，缓冲液处理后加抗原修复液Ⅰ修复抗原。正常血清封闭液室温处理后滴加NFκB抗体，4 ℃过夜。复温后滴加兔抗鼠IgG二抗，SABC法染色，DAB显色，苏木精轻度复染，二甲苯透明，中性树脂封片，细胞核染为棕黄色或棕褐色为阳性。应用Simple PCI医学图像分析系统，对视网膜组织中NFκB染色强度进行目标灰度测定，以灰度值代表NFκB表达的强弱(灰度值越大提示表达越弱)，测定结果以平均灰度值表示。

　　1.5 统计学分析

　　采用 SPSS 10.0及PPMS 1.5[6]统计学软件进行分析,多组间比较采用单因素方差分析。

　　2 结果

　　正常对照组大鼠视网膜组织内无NFκB阳性表达，未见黄色染色颗粒，NFκB蛋白灰度值高。模型组大鼠NFκB主要分布于视网膜内核层和神经节细胞的胞质及胞核内，染色呈棕黄色，NFκB蛋白灰度值低。缬沙坦组大鼠NFκB主要分布于视网膜内核层和神经节细胞的胞质及胞核内，染色呈棕黄色，NFκB蛋白灰度值较高。缓冲液组大鼠NFκB主要分布于视网膜内核层和神经节细胞的胞质及胞核内，染色呈棕黄色，NFκB蛋白灰度值低。正常对照组、模型组、缬沙坦组、缓冲液组大鼠NFκB表达水平分别为173.26±5.73、132.49±6.28、151.18±4.51、130.97±5.19，后3组均较正常对照组增高(F=262.00，q=18.06～34.59，P<0.01)，缬沙坦组NFκB表达水平较模型组明显降低(q=15.29，P<0.01)。

　　3 讨论

　　长期高糖血症能诱导视网膜毛细血管周细胞凋亡，早期发生在毛细血管，后逐渐发生到小动脉，由于血管周细胞数量的下降，使血管通透性增加，血管间质水肿;同时减弱了其对内皮细胞的接触性抑制作用，引起血管基膜增厚、继而导致管腔狭窄或闭塞，形成微血管瘤，进一步发展则出现视网膜硬性渗出、棉绒斑、视网膜出血、新生血管和纤维组织的增生，最终导致牵引性视网膜脱离。

　　NFκB又称κ基因结合核因子，是广泛存在于细胞中的具有多向性调节作用的蛋白质分子，它首先在1986年从B淋巴细胞的提取物中检测到[7]，因最先发现其结合部位位于编码B细胞免疫球蛋白κ轻链基因的增强子中而得名。NFκB是一类参与一系列基因表达调控的关键性核转录因子，它通常以二聚体形式与核因子抑制蛋白(IKB)结合呈无活性状态存在于多种细胞的胞浆中，多种不同的刺激因素(如炎症、细胞因子、病毒、紫外线、ROS等)可促使NFκB表达活化，并参与细胞生长、分化、黏附、凋亡及炎症等反应。

　　研究证实，当体内长期出现血糖紊乱时，可导致肾素血管紧张素系统(RAS)活性增高，组织中Ang Ⅱ含量增加，从而使ROS的合成增加，ROS可通过激活丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号传导通路，使IKB磷酸化而被降解，从而与NFκB分离，周细胞内NFκB被激活，促凋亡因子Bax过度表达，引起周细胞凋亡、血视网膜屏障破坏，视网膜毛细血管通透性增高[7]。本文结果显示，高糖诱导视网膜病变模型组12周时视网膜组织NFκB的表达较正常对照组显著增高(P<0.01)，证明高糖血症促进了NFκB过度表达。MAMPUTU等[8]研究证实，高糖血症时NFκB被激活，它能正向调节VEGF mRNA及其蛋白表达，而VEGF又能增强NFκB的结合能力，增加视网膜内皮细胞的增殖，它们共同促进新生血管的形成，最终导致视功能损害等，因此推测可能高糖诱导视网膜病变的发生与视网膜表达的NFκB增加了VEGF的表达也有关。

　　缬沙坦是ATⅠ受体拮抗剂，它对ATⅠ有高度选择性、专一性和高亲和力，可竞争性拮抗Ang Ⅱ。它通过结合ATⅠ，阻断RAS，从而减少ROS含量，改善氧化应激，进而降低NFκB表达，抑制VEGF表达。本文结果显示，缬沙坦组大鼠视网膜内NFκB的表达较模型组显著降低(P<0.01)，推测缬沙坦通过降低DR大鼠视网膜内NFκB的表达，抑制了视网膜组织VEGF的表达，延缓了DR的发展。但缬沙坦并未完全阻断NFκB表达,这是因为视网膜局部 RAS激活不是DR发生发展的惟一机制,氧化应激、蛋白非酶糖基化终产物的异常沉积等因素也起着一定的作用[9]。

　　总之,本实验证明了缬沙坦能够降低高糖血症时视网膜组织NFκB的表达，从而延缓了DR的发展，为治疗DR提供了新的思路，但其中的具体机制还不是太清楚，仍需进一步研究。

　　【参考文献】

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