TGFβ2对体外培养牛晶状体上皮细胞CTGF蛋白及mRNA表达的影响

　　作者：陈博　　作者单位：430022)中国湖北省武汉市,华中科技大学同济医学院附属协和医院1眼科,2急诊科

　　【摘要】观察转化生长因子β2(transforming growth factorβ2，TGFβ2)对体外培养牛眼晶状体上皮细胞(lens epithelial cell，LEC)结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)mRNA和蛋白表达的影响。方法:将体外培养2～3代牛LEC分为对照组和实验组，实验组分别经1，5，10μg/L TGFβ2处理24h后，采用半定量RTPCR和Western blot技术检测CTGF mRNA以及蛋白表达的变化。结果:与对照组相比，1μg/L TGFβ2组对牛LEC CTGF/βactin吸光度比值和CTGF/βactin灰度比值的表达无明显影响(P>0.05)，5，10μg/L TGFβ2组可以明显上调RTPCR和Western blot中CTGF/βactin比值(P<0.01)。结论:TGFβ2可促进体外培养牛LEC表达CTGF蛋白及mRNA。

　　【关键词】 转化生长因子,晶状体上皮细胞,结缔组织生长因,白内障

　　0引言

　　病理学研究发现白内障术后后囊混浊(posterior capsule opacification, PCO)的发生源于晶状体上皮细胞(lens epithelial cell, LEC)发生上皮间质转分化的过程[1]。近年来的研究表明，转化生长因子β(transforming growth factorβ, TGFβ)在LEC的转分化过程中发挥了核心作用[15]。但长期完全阻断TGFβ的表达和活性可能引发严重的不良反应[6]。因此，深入研究TGFβ诱导LEC发生转分化的具体机制，寻找更为精确的下游靶点是PCO防治研究工作今后的方向。有研究表明，结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF )在多种细胞转分化的过程中介导了TGFβ的作用[79]。Wunderlich等[10]曾用原位杂交和RTPCR发现人白内障术后发生PCO的后囊膜有CTGF的mRNA表达，与它同时表达的还有肌成纤维细胞的表型标志α平滑肌肌动蛋白，表明CTGF可能在PCO的发生中发挥了重要作用。TGFβ2对PCO发生机制研究中人LEC常用的替代材料牛LEC CTGF表达的影响尚未见报道。我们拟观察TGFβ2对牛LEC CTGF在转录水平以及翻译水平上表达的影响，为深入研究CTGF在TGFβ介导的LECs的转分化过程中的可能作用奠定基础。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　牛眼取自屠宰场，用自来水冲洗后，剪去周围结缔组织，以2000U/L庆大霉素浸泡30min，DHanks液漂洗3次，沿角膜缘后5mm处环形剪开眼球，用显微剪沿晶状体剪断悬韧带，完整娩出晶状体。晶状体娩出后，沿晶状体赤道部后2～3mm处环形剪开晶状体，显微镊将晶状体前囊膜小心撕下，细胞面朝上平铺于培养皿中。加入2.5g/L胰蛋白酶消化10～15min，消化过程中，用吸管轻微吹打，促进细胞脱落。然后加入DMEM培养液(Hyclone 公司产品，含200mL/L胎牛血清，100kU/L的青链霉素)中止消化，将混合液体吸出，转入50mL培养瓶，置于含50mL/L CO2, 37oC恒温培养箱中培养。24h后换液，待细胞长出后，每3d换液1次。以2.5g/L胰蛋白酶消化传代。

　　1.2方法

　　取2～3代牛LEC以1×106个/孔的浓度接种于6孔培养板内，24h吸出培养液，用低浓度血清培养基(含10mL/L胎牛血清)孵育10h后，DHanks液洗3次，实验组加入含TGFβ2(Peprotech公司产品)的无血清DMEM培养液(Hyclone公司产品)1mL(浓度分别为1，5，10μg/L)，对照组加入不含TGFβ2的等体积无血清培养液。

　　1.2.1 RTPCR测定CTGF mRNA的表达

　　24h去除培养液后，每孔加入Trizol(Invitrogen公司产品)1mL，适当的振荡和吹打。10min后收集Trizol，加入氯仿200μL，摇匀，4oC 14000r/min离心15min。取上清0.5mL加入等体积的异丙醇沉淀总RNA，4oC 14000r/min离心10min，去上清，加入750mL/L乙醇1mL洗涤沉淀，4oC 7500r/min离心5min。去上清，加入DEPC水20μL溶解沉淀，低温保存备用。按照试剂盒上说明进行逆转录(Toyobo公司产品)：去RNA酶水8μL，RT缓冲液4μL，dNTP混合物2μL，RNA酶抑制剂1μL，Oligo(dT)20 1μL，总RNA 3μL，逆转录酶1μL一共20μL体系。放入PCR扩增仪(Biometra公司产品)后，按照30oC退火10min，42oC反应20min，99oC反应5min，4oC中止5min的体系进行逆转录制备cDNA。PCR体外扩增cDNA。牛CTGF上游引物：5’TTGTGTACACGTGATTTCAGTGGC3’;下游引物：5’ATCACTGCCTCACCTTCAGCAAAC3’， 扩增后片断长度763bp。内参照βactin上游引物：5’GAGGATCTTCATGAGGTAGTCTGTCAGGTC3’;下游引物：5’CAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCA3’，扩增后片断长度349bp。采用25μL的PCR反应体系：去离子水14μL，10mmol/LdNTP 1μL，PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl21.5μL，上游引物1.5μL，下游引物1.5μL，模板cDNA 2μL，Tag 酶1μL。PCR扩增条件：94oC预变性5min，94oC变性40s，57.2oC(CTGF)，54oC(βactin)退火40s，72oC延伸40s，31次循环后，72oC延伸5min。扩增产物经过20g/L的琼脂糖凝胶电泳后，于紫外线箱中观察并照相记录，分子量标记物选用天为时代公司DNA Maker II。

　　1.2.2 Western blotting检测BLEC合成CTGF 24h去除培养液后，将培养板置于0oC的平板上，加入50μL每孔细胞裂解液(50mmol/LTrisHCl, pH7.2, 1mmol/L EDTA, 150mmol/L NaCl, 1g/L SDS, 5g/L去氧胆酸钠，10g/L NP40，1mmol/L PMSF, 10g/L Aprotinin)冰上孵育30min，期间给予适当振荡和吹打。30min后收集细胞裂解物，于4oC以12000r/min 离心10min，取上清Bradford法测蛋白浓度。取蛋白60μg上样于75g/L聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳后转移样品蛋白至NC膜(Biorad公司产品)上。随后将膜于50g/L脱脂奶粉封闭液中室温封闭2h后，以1∶500抗CTGF抗体(Santa Cruz公司产品)4oC孵育过夜。用TBST(50mmol/L TrisHCl, pH7.6,150mmol/L NaCl,3g/L Tween20)洗膜3次，加1∶2000的HRP标记的二抗(博士德公司产品)室温孵育1.5h。TBST洗膜3次后，浸入增强化学发光(ECL)试剂(Pierce公司产品)，暗室X线片压片曝光2min，洗片。

　　Western blotting和RTPCR电泳图片经光密度图像扫描仪(HP)扫描，经IMAGE Quant(Alpha Innotech 公司产品)程序对条带进行灰度以及吸光度测定。

　　统计学处理：所有实验均重复3次，数据用均数(标准差来表示，采用单因素方差分析，以上统计均由SPSS13.0 软件包处理(显著水平α=0.05)。

　　2结果

　　2.1TGFβ2 对牛LEC CTGF mRNA表达的影响

　　原代牛LEC于培养48h内贴壁生长，可见牛LEC形态如纺锤样(图1)。RTPCR产物电泳结果显示，正常对照组和实验组均在763bp和374bp处出现特异性CTGF和βactin基因条带(图2)。1μg/L TGFβ2处理组CTGF/βactin条带吸光度比值与对照组相比，差异无显著性意义(P>0.05)，5μg/L和10μg/L TGFβ2处理组CTGF/βactin比值与对照组相比，差异有显著意义(P<0.01, F=288.74,图3)。

　　2.2 TGFβ2对牛LEC CTGF蛋白表达的影响

　　SDSPAGE凝胶电泳结果显示，正常对照组和实验组均有分子质量分为38kDa和43kDa的CTGF和βactin蛋白条带(图4)。1μg/L TGFβ2处理组CTGF/βactin灰度比值与对照组相比无显著性差异(P>0.05)，5μg/L和10μg/L TGFβ2处理组CTGF/βactin灰度比值与对照组相比，差异有显著意义(P<0.01, F=301.59,图5)。

　　3讨论

　　白内障是世界上排名首位的致盲性眼病。手术是目前治疗白内障脱盲的唯一方法。但术后5a内约有20%～50%的患者因为发生PCO而出现视力再次下降[14]。因此，彻底阐明PCO的发病机制，寻找有效的防治方法是目前提高白内障手术脱盲远期疗效的当务之急。病理学研究发现，PCO的发生源于白内障手术破坏了LEC和囊膜的完整性，诱发晶状体自身创伤修复反应，即LEC发生上皮间质转分化的过程[1]。由LEC转化而来的肌成纤维细胞，增殖、移行到位于光学通路上的晶状体后囊膜表面，合成分泌大量细胞外间质，形成混浊斑快，表达肌成纤维细胞的表型标志α平滑肌肌动蛋白和I型胶原，通过LEC收缩使后囊皱缩，阻挡光线通过并引起散光，从而严重影响患者的视力。

　　近年来的研究表明，TGFβ在LEC的转分化过程中发挥了核心作用[15]。将LEC暴露于TGFβ的作用之下，包括体外LEC培养、体外晶状体器官培养、转基因动物及直接眼内注射等研究都发现LEC出现的细胞和分子水平改变与PCO病理学所见一致。而在晶状体穿通伤的动物模型和白内障术后的LEC内可见到自体TGFβ信号途径被激活。这些发现说明TGFβ通过自/旁分泌方式作用于LECs，使之发生上皮间质转分化，阻抑TGFβ诱导的上皮间质转分化是有效防治PCO的关键。但TGFβ作用广泛，在调节细胞分化、个体发育、免疫及炎症过程中发挥重要作用，长期完全阻断它的表达和活性可能引发严重的不良反应[6]。因此，深入研究TGFβ诱导LEC发生转分化的具体机制，寻找更为精确的下游靶点才是PCO防治研究工作今后的方向。

　　CTGF是新近报道的高度保守的即刻早期基因CNN家族成员之一，在细胞增殖、细胞移行、细胞外基质合成、细胞表型转化等方面发挥重要作用[15]。 在CTGF基因启动子序列中存在特异的TGFβ和Smad的反应元件, 可影响启动子对TGFβ的反应活性[15]。作为TGFβ的下游效应因子，CTGF与TGFβ介导的机体的创伤修复和组织纤维化过程密切相关[15]。有研究表明，CTGF在多种细胞，包括肾小管上皮细胞，肺、肾、皮肤成纤维细胞，肝星形细胞向肌成纤维细胞转分化的过程中介导了TGFβ的作用, 利用CTGF中和抗体或反义寡核苷酸能有效阻断TGFβ对细胞转分化的诱导作用[79]。作为TGFβ发挥纤维化作用的下游因子，CTGF生理状态下表达低，生物学作用相对单一[15]，因此深入研究CTGF在TGFβ介导的LEC的转分化过程中的可能作用及其表达调控，可为探索PCO的防治寻找新的靶点。Wunderlich等[10]曾用原位杂交和RTPCR发现人白内障术后发生PCO的后囊膜有CTGF的mRNA表达，与它同时表达的还有肌成纤维细胞的表型标志α平滑肌肌动蛋白，表明CTGF可能在PCO的发生中发挥了重要作用。郭海科等[16]曾有研究报道不同质量浓度TGFβ1 可诱导兔LEC表达CTGF蛋白。而作为房水中TGFβ的主要存在形式的TGFβ2[17]，在10μg/L的浓度可以明显促进体外培养人LEC表达CTGF的mRNA[18]。

　　由于牛LEC与人LEC生物学特性相似，而且有取材容易、细胞生长较快等特点，能够为实验提供大量生长状态好、生物性状稳定的细胞, 常作为人LEC的替代材料用于PCO的发病机制的实验研究。TGFβ2是否也能诱导牛LEC表达CTGF基因和蛋白，尚未见报道。本实验观察了TGFβ2对牛LEC CTGF在转录水平以及翻译水平上表达的影响，以期为深入研究CTGF在TGFβ介导的LECs的转分化过程中的可能作用奠定基础。结果显示，在1μg/L浓度组，TGFβ2对CTGF的表达无明显影响，而在5μg/L和10μg/L浓度组，TGFβ2能够明显促进CTGFmRNA和蛋白的表达。至于CTGF在TGFβ2介导的LEC的转分化过程中究竟发挥了怎样的作用还有待进一步研究。

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