磁共振成像对活体兔结膜下药物注射后渗透性的评价作

　　作者：毛晓春，李贵刚，李彬，陈辉，杜龙庭，张虹 作者单位：1.华中科技大学同济医学院附属同济医院 眼科，湖北 武汉 430030;2.华中科技大学同济医学院附属襄樊医院 放射科，湖北 襄樊 44102

　　【摘要】 目的 使用磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)评价兔结膜下药物注射后的渗透性和清除率，探讨一种能够在活体内动态观察的眼部药代动力学检测方法。方法 健康新西兰白兔24只，按随机数字表法分为3组，每组8只，取右眼作为实验眼，对侧眼作为对照眼。以MRI的造影剂钆喷酸葡胺(Gadolinium-diethylene triamine pentaacetic acids，Gd-DTPA)作为示踪剂，分别于结膜下注射0.5 mol/L、0.05 mol/L、0.005 mol/L造影剂0.1 ml，对照眼注射0.9%生理盐水0.1 ml。采用MRI扫描仪，于注药后1 h内每间隔15 min左右扫描1次，2~3 h内间隔30 min左右扫描1次，通过MRI观察药物的渗透性、眼内分布及结膜下的清除速度。0.5 mol/L组于术前和术后24 h进行角膜内皮镜检查，观察角膜内皮细胞密度、内皮细胞面积变异系数、六边形细胞百分数和中央角膜厚度。使用Excel绘制信号增强率对时间曲线，采用配对t检验分析角膜内皮细胞密度变化。结果 MRI扫描可见：0.5 mol/L组前房及睫状体信号明显增强，而眼后段则未探测到高信号;0.05 mol/L组前房信号无明显增强，接近注射位置的睫状体信号增强;0.005 mol/L组眼前、后段的药物渗透浓度均低于MRI探测阈值。睫状体部位对药物经巩膜的被动转运阻力最低，结膜下药物的体积和浓度随时间逐渐下降。结膜下Gd-DTPA用药前后，0.5 mol/L组的角膜内皮细胞密度、内皮细胞面积变异系数、六边形细胞百分数和中央角膜厚度差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 MRI作为非侵袭、动态、实时的检查方法可于活体内定量分析结膜下药物注射后的渗透效率，是对传统药代动力学研究方法的有力补充。

　　【关键词】 磁共振成像;Gd-DTPA;结膜下注射;药代动力学;经巩膜药物转运

　　1Assessment of subconjunctival delivery of ionic permeants in rabbits with Gd-DTPA and magnetic resonance imaging in vivo

　　MAO Xiaochun， LI Guigang， LI Bin， et al.

　　Department of Ophthalmology， Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan China， 430030

　　[Abstract] Objective To assess the permeability and clearance rate of a model for ionic permeants after subconjunctival injection using nuclear magnetic resonance imaging (MRI); to investigate a pharmacokinetic method for the ocular region in vivo. Methods Twenty-four rabbits were randomly divided into three groups according to a random numbers table， taking the right eye as the experimental eye and the left eye as the control eye. Experimental eyes in each group received subconjunctival injections of 0.5 mol/L，0.05 mol/L and 0.005 mol/L as a contrast agent. The control eyes received a subconjunctival injection of isotonic NaCl. All eyes were scanned once every 15 min for the first hour and once every 30 min for the next 2~3 hours. The permeability， distribution and subconjunctival clearance rate of the drugs were observed with MRI. The corneal endothelial cell density (ECD)， coefficient of variance of the endothelial cell area (CV)， percentage of hexagonal cells (6A) and central corneal thickness (CCT) were examined before and 24 h after the subconjunctival injection of the 0.5 mol/L contrast agent using a non-contact corneal endothelial microscope. The signal enhancement rate vs. time curve was plotted with Microsoft Excel software and statistical analysis of the changes in the corneal endothelium was done using a paired t-test. Results In the 0.5 mol/L group， there was an obvious strengthening of the signal in the anterior chamber and ciliary body， however， a strong signal was not detected in the posterior segments. In the 0.05 mol/L group， there was no obvious strengthening of the signal in the anterior chamber but the signal in the ciliary body close to the injection site strengthened. In the 0.005 mol/L group， the drugs and the osmotic concentration in the anterior and posterior segments of the eyes were below the detection threshold with MRI. The trans-scleral passive transport resistance of drugs was the lowest in the ciliary body. The subconjunctival pharmacological volume and concentration gradually decreased over time. There were no significant differences in ECD， CV， 6A and CCT before and after the experiment in the 0.5mol/L group (P>0.05). Conclusion Subconjunctival delivery of ionic permeants in vivo can be quantitatively analyzed by MRI. MRI is a noninvasive， dynamic and real-time complementary technique to traditional pharmacokinetic methods.

　　[Key words] magnetic resonance imaging; Gd-DTPA; subconjunctival injection; transscleral drug delivery; pharmacokinetics

　　结膜下注射是眼病治疗的常规手段，如激素、抗菌素结膜下注射后，药物直接通过组织持续渗透进入眼内。虽然结膜下注射在临床上已广泛使用，但在体结膜下注射的药代动力学研究还未完全明了。本研究以MRI的造影剂钆喷酸葡胺(Gadolinium-diethylene triamine pentaacetic acids，Gd-DTPA)作为示踪剂，通过MRI动态观察结膜下注射药物的渗透性、眼内分布及结膜下清除率，同时观察原浓度Gd-DTPA对角膜内皮细胞形态及角膜厚度的影响，以期探讨一种在活体内、动态、实时的眼部药代动力学检测方法。

　　1 资料和方法

　　1.1 实验动物

　　健康清洁级新西兰白兔24只，雌雄不限，体重2.0～2.6 kg(由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供)。实验动物按随机数字表法分为3组，每组8只，取右眼作为实验眼，对侧眼作为对照眼。实验眼分别于结膜下注射0.5 mol/L、0.05 mol/L、0.005 mol/L Gd-DTPA造影剂，对照眼注射生理盐水。

　　1.2 仪器和试剂

　　Siemens Magnetom Avanto 1.5 T超导型MRI扫描仪(德国)，非接触式角膜内皮照相仪(SP29000型，日本)，Gd-DTPA(北京北陆药业股份有限公司)。

　　1.3 药物注射

　　以氯胺酮30 mg/kg、氯丙嗪15 mg/kg 肌肉注射使动物全身麻醉(扫描过程中每40 min重复肌肉注射同等剂量的麻醉剂)后，使用1 ml注射器，于12点位角巩缘后2～3 mm进针，术中应避免巩膜穿孔，之所以选择上方结膜是因为上方的可利用空间比下方大，注射药物分别为0.5 mol/L、0.05 mol/L、0.005 mol/L的Gd-DTPA 0.1 ml(以生理盐水稀释)，对照组注射0.9%的生理盐水0.1 ml，冲洗结膜囊后，立即进行MRI扫描。

　　1.4 MRI检查方法

　　实验动物取仰卧位固定于自制扫描架上，采用膝关节专用线圈。MRI平扫与增强体位、序列及参数相同，采用SE T1WI(TR 480 ms，TE 14 ms)加脂肪抑制，横断位，层厚2 mm，间隔0.2 mm，视野(field of vision，FOV)13 cm×13 cm，像素256×256，激励次数3，扫描时间8 min 42 s。1 h内每间隔15 min左右扫描1次，2~3 h间隔30 min左右扫描1次;结膜下注射Gd-DTPA后扫描的体位、序列及参数与平扫相同。实验完成24 h后再次扫描，观察眼内有无Gd-DTPA残留。

　　1.5 感兴趣区信号增强率对时间曲线的绘制

　　影像分析由同一名MRI诊断医师应用MRI工作站完成，分别测量三个感兴趣区(睫状体、前房、后房)的平均信号强度，前房、睫状体、后房分别选择100、15、5个像素，选择的像素均在解剖结构之内，避开边界区以防止信号干扰。感兴趣区信号增强率(E)由以下公式计算：E=(St-S0)/S0。St是结膜下注射造影剂后某时间点的感兴趣区信号强度，S0是同一区域注射造影剂前的信号强度。

　　1.6 角膜内皮细胞形态及角膜厚度的测量

　　为了解Gd-DTPA对角膜内皮细胞的毒性，0.5 mol/L组结膜下注射前及注射后24 h采用非接触式角膜内皮镜测量角膜内皮细胞密度(corneal endothelial cell density，ECD)、内皮细胞面积变异系数(coefficient of variation of the endothelial cell’s area，CV)、六边形细胞的百分数(percentage of hexagonal cells，6A)及中央角膜厚度(central corneal thickness，CCT)。

　　1.7 统计学方法

　　本实验所有数据以x±s表示，信号增强率对时间曲线使用Excel绘制，角膜内皮分析采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，统计方法为配对t检验。

　　2 结果

　　2.1 兔眼的MRI扫描

　　正常兔眼结构清晰，MRI平扫见图1。图2显示兔结膜下注射0.5 mol/L、0.05 mol/L、0.005 mol/L浓度的Gd-DTPA后的MRI影像。各组结膜下的低信号区和高信号区(上眼睑/结膜与巩膜/玻璃体之间的暗区和明亮区)分别为不同浓度Gd-DTPA的沉积处。结膜下注射0.5 mol/L Gd-DTPA后，在0.5 h内可见前房、睫状体信号增强，随时间延长，睫状体信号强度减低;前房信号强度逐渐升高，3 h时前房仍为高信号;0.05 mol/L组前房信号无明显增强，接近注射位置的睫状体信号增强;而0.005 mol/L组前房和睫状体信号均未见增强。在3 h的观察期内，结膜下注射3种浓度的Gd-DTPA，均未见后房、玻璃体的信号改变。对照组结膜下注射盐水，前房内未探测到高信号，45 min左右盐水基本吸收。在3 h观察期内实验组结膜下Gd-DTPA未完全消失。24 h后眼内无Gd-DTPA残留。

　　2.2 感兴趣区信号增强率对时间曲线

　　图3为各组平均信号增强率对时间曲线。感兴趣区分别为睫状体、前房、后房，睫状体信号在结膜下注射Gd-DTPA约15~25 min后快速增强，达到高峰后逐渐减弱;前房的信号在研究时限内缓慢增强，而后房未发现信号增强。

　　2.3 角膜厚度及角膜内皮细胞形态学改变

　　结膜下注射各种浓度造影剂并完成3 h的检查后，使用裂隙灯显微镜观察，角膜、晶状体保持透明，结膜、角膜无水肿，角膜内皮镜检查结果见表1。结膜下注射前及注射后24 h，角膜内皮细胞密度(ECD)、内皮细胞面积变异系数(CV)、六边形细胞的百分数(6A)及中央角膜厚度(CCT)比较，差异均无统计学意义。

　　3 讨论

　　眼部疾病往往需要有效的药物浓度到达局部治疗部位，当前的治疗主要是重复的眼周注射、玻璃体内注药及高剂量的全身用药。大剂量的全身用药易导致毒性反应，且血-房水屏障阻碍了大部分药物经血循环进入眼内[1]。局部用药是治疗眼科疾病最常用、最有效的方法，然而由于眼内存在血-房水、血-视网膜等诸多屏障，如何维持局部的有效药物浓度，同时避免某些药物的长时间存留而导致的副作用显得尤为重要，因此有必要为局部的药物代谢提供一个很好的检测方法和手段。

　　荧光标记法、放射自显影术及组织内药物萃取是研究眼的药物渗透和清除的传统方法。荧光标记法[2]及药物萃取[3]需要处死大量动物，并且不能完全抽取用于分析的药物;放射自显影技术[4]可以定量分析，但缺乏药物的空间分布信息。同时，传统药代动力学研究方法取样过程中存在药物的重新分布，不能了解后房情况等。我们需要一种能够在活体内动态、实时、可重复、连续观察、非侵袭性的研究手段。

　　随着MRI技术水平的进步，其在眼科的应用逐渐扩展，并且成为眼部药代动力学研究的新方法。MRI能够于给药期间及给药以后确定造影剂标记药物的分布及排出途径，能够在单个动物眼内确定药物转运梯度，并且提供准确的空间信息，使定量研究药物的渗透、分布及房水流动成为可能，是对传统药代动力学研究的有力补充[1]。

　　本研究结果发现，活体兔眼结膜下注射一定浓度的Gd-DTPA后，睫状体信号快速增强，继而缓慢下降，而前房信号随时间逐渐增强，同时，造影剂局限于前房内，玻璃体、后房信号均未增强。Kolodny等[5]通过静脉注射造影剂观察其在兔眼内的分布，表现为睫状体信号快速增强、前房信号逐渐升高而后房始终为低信号。Bert等[6]使用同样的方法观察人眼，得出相同的结论。静脉注射及结膜下注射所观察到的药物在眼内的浓度梯度与预期的结果不同：传统观点认为药物由睫状体进入后房，随房水流动进入前房;而本研究结果提示，药物进入前房与房水分泌路径不同，可能存在旁路，即药物由睫状体经虹膜根部进入前房，并不经过后房。由于Gd-DTPA为小分子化合物并且不与血浆蛋白结合，能够通过大分子物质不能通过的屏障。如果Gd-DTPA不能进入后房，可以推测血浆源性蛋白同样不能进入后房，那么前后房水成分之间可能存在差异，即存在前-后房屏障，是血-房水屏障的组成部分。其解剖和生理学基础是：房水自后房向前房连续、单向流动限制了前房内的溶质向后房扩散;虹膜前表面无上皮;虹膜后表面上皮细胞之间的紧密连接[7]。

　　本研究发现，结膜下注射Gd-DTPA后，眼后段药物渗透浓度较低，与以前的研究结果相一致。如此前的研究报道，结膜下注射环胞霉素、头孢曲松钠等，玻璃体测得的浓度很低。在所有的研究中，玻璃体内的药物浓度均低于注射浓度的0.05%[8]。传统药代动力学研究方法并不适用于健康受试人，人眼的药代动力学研究很少见，多于白内障或玻璃体切割手术前后进行，其研究结果同样提示玻璃体内的药物浓度远低于前房[9]。这提示可能有其他的吸收屏障(除了巩膜之外)和阻碍药物渗透的条件存在。可能的吸收屏障包括：泪膜，巩膜外和结膜的血流，结膜淋巴引流，脉络膜血流，以及脉络膜组织和巩膜外静脉之间的流体压力的不同造成的反向对流[10]。Kim等通过动态增强磁共振扫描(dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging，DEC-MRI)研究结膜下植管持续给药Gd-DTPA的眼内渗透性[11]及不同分子量药物结膜下的清除速率[12]，与本研究结果不同，其眼前段及眼后段均未检测到高信号。分析其眼前段信号无增强的原因，可能是药物浓度低(Gd-DTPA分别稀释100倍及500倍)，用药部位位于球周，药物很快被结膜的血管及淋巴系统清除。本研究和此前的研究数据提示，经巩膜被动转运不能给予足够的药物至眼后段，除非需要的药物治疗浓度较小或者注入更高浓度的药物。

　　本研究的MRI影像显示，药物经结膜下进入眼内的渗透路径接近睫状体，这说明睫状体区域对药物的跨巩膜转运阻力最低，因为包括兔在内的大多数物种睫状体的血液流动速度相对脉络膜要慢，造影剂经静脉引流得更少，而且睫状体和脉络膜内也没有淋巴引流。药物从睫状体无色素上皮组成的紧密联接通过胞饮作用、渗透梯度以及载体介导的主动转运系统进入房水[13]。

　　Gd-DTPA是非常安全的对比剂，动物实验证明它全身用药的半数致死量为常规用量的40倍[14]。然而，既然局部使用相对浓度高，就有必要了解其对角膜的影响。本研究证实0.5 mol/L的Gd-DTPA结膜下注射对角膜无明显毒性，24 h后重复扫描未见Gd-DTPA残留。

　　然而，将本研究结果推论到人眼时，必须考虑其与兔眼在解剖和生理上的不同。虽然兔和人巩膜的渗透性相似，但兔眼的巩膜更薄，这可能对药物转运有一定影响。此外，兔脉络膜血管的渗透性和血液流动与灵长类动物不同，兔的脉络膜血流更快，这可能增加了药物的清除作用[15]。此外，药物的分子量、分子半径、溶解度均会影响其眼内的渗透性[16]，Gd-DTPA作为低分子量、亲水性化合物，其眼内的药代动力学并不适用于所有药物。

　　我们的研究扩展了MRI及Gd-DTPA在眼部药代动力学的应用，然而还有一些方面需要更进一步的研究，如信号强度与Gd-DTPA浓度的相关性，局部及全身应用药物在眼部的摄取和转运机制，药物从前房消除的路径和过程等。总而言之，MRI能够以可重复的、客观的和非侵袭性的方式提供眼内结构及代谢数据，其用于临床和科学研究具有众多优点，MRI作为我们理解眼部疾病的病理改变、明确疾病分期及评估疗效的工具必将有更大发展。

　　【参考文献】

　　[1] Li SK， Lizak MJ， Jeong EK. MRI in ocular drug delivery[J]. NMR Biomed，2008，21(9)：941-956.

　　[2] Lee SJ， Kim ES， Geroski DH， et al. Pharmacokinetics of intraocular drug delivery of oregon green 488-labeled triamcinolone by subtenon injection using ocular fluorophotometry in rabbit eyes[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49(10)：4506-4514.

　　[3] Gaudreault J， Fei D， Beyer JC， et al. Pharmacokinetics and retinal distribution of ranibizumab， a humanized antibody fragment directed against VEGF-A， following intravitreal administration in rabbits[J]. Retina，2007，27(9)：1260-1266.

　　[4] Nakahori Y， Katakami C. The effect of epidermal growth factor on corneal endothelial wound healing in rabbits[J]. Nippon Ganka Gakkai Zasshi，1995，99(1)：17-22.

　　[5] Kolodny NH， Freddo TF， Lawrence BA， et al. Contrast-enhanced magnetic resonance imaging confirmation of an anterior protein pathway in normal rabbit eyes[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1996，37(8)：1602-1607.

　　[6] Bert RJ， Caruthers SD， Jara H， et al. Demonstration of an anterior diffusional pathway for solutes in the normal human eye with high spatial resolution contrast-enhanced dynamic MR imaging[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2006，47(12)：5153-5162.

　　[7] Freddo TF. Shifting the paradigm of the blood-aqueous barrier [J]. Exp Eye Res，2001，73(5)：581-592.

　　[8] Hainsworth DP， Conklin JD， Bierly JR， et al. Intravitreal delivery of ciprofloxacin[J]. J Ocul Pharmacol Ther，1996，12(2)：183-191.

　　[9] Weijtens O， Feron EJ， Schoemaker RC， et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection[J]. Am J Ophthalmol，1999，128(2)：192-197.

　　[10] Missel PJ. Hydraulic flow and vascular clearance influences on intravitreal drug delivery[J]. Pharm Res，2002，19：1636-1647.

　　[11] Kim SH， Galbán CJ， Lutz RJ， et al. Assessment of subconjunctival and intrascleral drug delivery to the posterior segment using dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48(2)：808-814.

　　[12] Kim SH， Csaky KG， Wang NS， et al. Drug elimination kinetics following subconjunctival injection using dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging[J]. Pharm Res， 2008，25(3)：512-520.

　　[13] Kim H， Robinson MR， Lizak MJ， et al. Controlled drug release from an ocular implant： an evaluation using dynamic three-dimensional magnetic resonance imaging[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2004，45(8)：2722-2731.

　　[14] Kim H， Lizak MJ， Tansey G， et al. Study of ocular transport of drugs released from an intravitreal implant using magnetic resonance imaging[J]. Ann Biomed Eng，2005，33(2)：150-164.

　　[15] Molokhia SA， Jeong EK， Higuchi WI， et al. Examination of penetration routes and distribution of ionic permeants during and after transscleral iontophoresis with magnetic resonance imaging[J]. Int J Pharm，2007，335(1-2)：46-53.

　　[16] Ambati J， Canakis CS， Miller JW， et al. Diffusion of high molecular weight compounds through sclera[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41(5)：1181-1185.