半乳糖性白内障大鼠晶状体中二肽基肽酶II的表达

　　作者：田蕊　　作者单位：中国吉林省长春市，吉林大学第二医院眼科医院

　　【摘要】 研究二肽基肽酶II(dipeptidyl peptidase II,DPPII)在D半乳糖性白内障大鼠晶状体和正常大鼠晶状体中含量的变化，探讨DPPII与白内障发病的关系。方法：建立D半乳糖性白内障大鼠动物模型，进行相应分期分组，应用Western blot方法检测DPP II在各组白内障大鼠及正常大鼠晶状体中含量变化。结果：DPPII在各组D半乳糖性白内障大鼠晶状体中的含量明显高于同期正常对照组，并且随着晶状体混浊程度的加重而增加。结论：DPPII在D半乳糖性白内障大鼠晶状体中的含量增加，可能与白内障发病相关。

　　【关键词】 二肽基肽酶II Western blot 白内障,晶状体

　　0引言

　　白内障是全球第一位致盲眼病，年龄相关性白内障是最为常见的白内障类型。随着白内障病因学研究的不断深入，许多国内外专家学者认为晶状体蛋白的不可逆变性是导致白内障形成的主要原因[1,2]。

　　外切肽酶中的二肽基肽酶II(dipeptidyl peptidase II, DPPII)是一种细胞内溶酶体蛋白酶，通过它在不同细胞、体液及器官中的定位，已有学者证明DPPII在细胞分化和防止细胞死亡的过程中发挥重要作用;并在胶原片断、肌纤维蛋白和短神经肽的降解中发挥作用[3]。我们通过检测DPPII在正常大鼠和D半乳糖性白内障大鼠晶状体中含量的变化，探讨DPPII与白内障发病的关系，为白内障的病因学研究提供新的理论依据。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　5～6wk龄的两性Wistar大鼠60只(吉林大学医学院实验动物中心提供)，体质量50～60g，雌雄兼用，经美多丽眼药水(日本参天制药株式会社提供)散瞳后裂隙灯检查其晶状体均透明。将大鼠随机分为正常对照组20只和半乳糖性白内障组即实验组40只。动物常规消毒，给实验组大鼠500g/L D半乳糖(捷瑞生物工程有限公司产品)溶液15g/kg，2次/d，ip;对照组大鼠同期等量无菌生理盐水，连续7～28d。定期给各组大鼠散瞳，裂隙灯下观察其晶状体的动态变化。按晶状体混浊性质及程度分为 I期(注射后1wk)：囊泡期;II期(注射后2wk)：皮质期;III期(注射后3wk)：成熟期;IV期(注射后4wk)过熟期。分别脱臼处死各期实验组大鼠和正常对照组大鼠，每期每组处死5只，取晶状体，分组分装后80℃保存。为了提高DPPII目的蛋白的含量，以助于观察其在白内障早期和晚期的变化，将实验动物人为分组：晶状体出现I，II期改变的大鼠划分为轻度白内障组，即实验1组;晶状体出现III，IV期改变的大鼠划入重度白内障组，即实验2组。正常对照组与实验组同期分为对照1组和对照2组。表1 PVDF膜上各DPPII蛋白条带的灰度分析值(略)

　　1.2方法

　　取各组大鼠晶状体各10枚，分别置于1mL样品缓冲液(50mmol TrisHCl，pH值8.0，2mmol EDTA，1mmol 2巯基乙醇)中，冰盒中匀浆搅碎，4℃离心，3000r/pm，20min，取上清，分装，80℃保存。用考马斯亮兰法(bradford法)测定各组样品的总蛋白浓度，根据所测得样品的总蛋白浓度，将各组样品总蛋白浓度调至相同水平备用。配制100g/L的分离胶，50g/L的浓缩胶，厚度1.0mm。将自备好的各组样品4倍稀释后加入1×SDS上样缓冲液，100℃水浴3min。加样，顺序依次为：DPPII蛋白纯品(吉林大学分子酶学工程516实验室从大鼠肾脏中提取)，对照1组，实验1组，对照2组，实验2组，蛋白Marker(华特生生物技术有限公司产品)，上样量为20μL/槽。恒流电泳，前沿条带跑至分离胶底沿时终止电泳。半干式电转110min,将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转至PVDF膜(Amersham公司产品)上。标记蛋白Marker。30g/L BSA封闭，37℃，55min。一抗(吉林大学分子酶学工程516实验室制备DPPII兔抗鼠多克隆抗体)(1∶500)封闭，4℃过夜。二抗(羊抗兔抗体，Santa Cruz生物技术公司产品)(1∶2000)封闭，室温4h。DAB显色液(武汉博士德试剂有限公司产品)，37℃，显色30min。照相，封存。利用Bandscan灰度扫描软件进行结果分析。

　　2结果

　　2.1 D半乳糖性白内障大鼠模型

　　裂隙灯显微镜下观察，正常对照组20只大鼠晶状体始终保持透明，实验组大鼠均出现不同程度的晶状体混浊。注射后1wk可观察到实验组大鼠晶状体周边出现空泡，晶状体呈轻度混浊;注射后2wk，晶状体周边空泡向中心扩展，中心核出现雾状混浊，晶状体混浊呈中度;注射后3wk，空泡扩展到核区，中心核雾状浑浊加重，晶状体呈高度浑浊;注射后4wk，整个晶状体呈肉眼可见的混浊。对照组大鼠无死亡。实验组大鼠发生死亡18只。

　　2.2大鼠晶状体中DPPII的含量

　　DPPII蛋白纯品条带出现在Marker带中蛋白分子质量为66kDa的下方，约为60kDa大小的位置;4组样品在DPPII蛋白纯品的同水平位置上均有条带出现，并且实验1组较对照1组显色深;实验2组较对照2组及其他两组显色均加深;对照2组较对照1组显色加深(图1)。应用Bandscan软件测各组样品DPPII蛋白条带的总灰度值 (total gray)及总灰度值的对数值 (log of total gray)，3次，取平均值(表1)。比较PVDF膜上各组样品中DPPII蛋白条带的显色情况，结合各组DPPII蛋白条带的总灰度值及其对数值的对比，得出结果：1)实验1组大鼠晶状体中DPPII的含量明显高于对照1组;实验2组大鼠晶状体中DPPII的含量明显高于对照2组。即实验组晶状体中DPPII的含量明显高于同期对照组。2)实验2组大鼠晶状体中DPPII的含量明显高于实验1组。3)对照2组大鼠晶状体中DPPII的含量高于对照1组。

　　3讨论

　　DPPII是二肽基水解酶亚类的第二位成员，是一种定位于囊泡系统的细胞内溶酶体蛋白酶，为外切肽酶的一种。普遍认为DPPII是由2个相同的糖基化蛋白链通过非共价键结合而成的二聚体。相关文献报道[4]天然DPPII的分子质量为100～130kDa，其亚单位的分子质量为50～65kDa。Huang等[5]从猪精浆中分离出DPPII，检测出其天然分子质量为185～200kDa，亚单位分子质量为61kDa，提出DPPII是由3个亚单位组成的结构。DPPII广泛存分布于脑、肾脏、生殖器官、体液、造血细胞等组织细胞中。早期组织化学研究结果证实：DPPII存在于啮齿类动物的晶状体中[6]。Willis等[7]在大鼠和猪的晶状体中检测出DPPII的生化活性，并推测其可能与白内障发病相关。张辉等[8,9]应用免疫组化方法检测到：DPPII存在于角膜上皮细胞、角膜基质层、角膜内皮细胞、睫状体无色素上皮细胞、虹膜色素上皮细胞、晶状体上皮细胞、晶状体纤维、视网膜神经纤维层、神经节细胞、视网膜色素上皮细胞;并且在SCR先天性白内障大鼠晶状体中DPPII的免疫活性较正常大鼠增强。有学者在电镜下观察到DPPII分布在晶状体溶酶体致密体中，这种溶酶体致密体最初被浓缩于晶状体赤道部和皮质缝，并且是一种皮质缝大量小体联合作用的反应产物。DPPII活性定位于皮质缝小体以及这些小体周围的纤维细胞间隙，这表明了DPPII可能在正常晶状体纤维细胞特定区域的分解代谢中发挥作用[6]。已有研究证明，当晶状体内Ca2+浓度升高时，一些内切肽酶(如calpain)被激活或活性增强，从而使晶状体蛋白被降解成肽片断，这些肽片断N末端暴露出能被DPPII等外切肽酶所特异性识别的氨基酸序列，而进一步被这些外切肽酶所降解，使晶状体蛋白失去其正常生理功能或由可溶性蛋白变为不可溶性蛋白，导致白内障的发生[1，10]。

　　大鼠半乳糖性白内障形成的病理过程与糖尿病性或老年性白内障基本相同，都是由于晶状体蛋白糖化而使其结构和功能发生改变，导致晶状体混浊。目前已广泛用于糖尿病性白内障和老年性白内障的病因学及治疗学等研究。是一种比较成熟的,并且得到公认的成功模型。本结果表明，在同期D半乳糖性白内障大鼠晶状体中，DPPII的含量高于正常大鼠晶状体，并随着晶状体混浊程度的加重，DPPII的含量明显增加。此结果与上述以往研究结论相符。白内障的病因学研究是一个错综复杂的课题，DPPII作为晶状体中众多外切酶之一，在白内障形成过程中所发生的生物学变化以及所发挥的具体作用，还有待于进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 Inomata M,Nomura K,Takehana M, et al. Evidence for the involvement of calpain in cataractogenesis in Shumiya cataract rat (SCR). Biochem Biophys Acta 1997;1362:1123

　　2 Andersson M, Sjostrand J, Karlsson JO. Proteolytic cleavage of NSuccLeuLeuValTyrAMC by the proteasome in lens epithelium from clear and cataractous human lenses. Exp Eye Res 1998;67: 231236

　　3 Maes MB, Scharpe S, De Meester I. Dipeptidyl peptidase II (DPPII), a review. Clin Chim Acta 2007;380：3149

　　4 Chiravuri M, Lee H, Mathieu SL, et al. Huber, Homodimerization via a leucine zipper motif is required for enzymatic activity of quiescent cell proline dipeptidase. J Biol Chem2000;275(35) ：2699426999

　　5 Huang K, Takagaki M, Kani K, et al. Ohkubo, Dipeptidyl peptidase II from porcine seminal plasma: purification, characterization, and its homology to granzymes, cytotoxic cell proteinases (CCP14). Biochim Biophys Acta 1996;1290(2)：149156

　　6 Swanson AA, Davis RM, Meinhardt NC. Proteases in human lenses and their possible significance. Curr Eye Res 1985;4(1):4348

　　7 Willis C, Gorthy, Daniel E, et al. Localization of the lysosomal protease dipeptidyl peptidase II in the young normal rat lens:a correlative light and electron microscopic analysis. Curr Eye Res1992;6:531542

　　8张辉，秦秀虹，崔永日，等.二肽基肽酶II在正常大鼠眼球各组织中的免疫表达.国际眼科杂志 2008;8(3):491493

　　9张辉，王宜，杨风娟，等. 先天性白内障大鼠晶状体中二肽基肽酶II免疫活性分析.吉林大学学报(医学版) 2007;33(3)：508509