药物联合眼底激光制作兔黄斑变性动物模型

　　作者：赵莼，罗敏，计菁，王志良，施沃栋，范先群 作者单位：上海交通大学附属第九人民医院 眼科，上海 200011

　　【摘要】 目的 应用1%过碘酸钠和眼底YAG-532倍频激光制作接近临床状态的年龄相关性黄斑变性的兔动物模型。方法 选用健康成年青紫蓝兔10只，美多丽散瞳后在全麻状态下行左眼眼底激光光凝，同时按40 mg/kg的剂量自兔耳缘静脉注入1%过碘酸钠溶液，考虑动物的生存质量，模型动物右眼均未予处理。建模后第2周和第1个月，分别观察动物眼底、眼底荧光素血管造影(fluoresscence fundus angiography，FFA)、动物视网膜电流图、眼部光学相干断层扫描(OCT)以及视网膜组织切片的改变。结果 模型动物中除1例意外死亡外，其余生存状态均良好。建模后第2周，模型动物眼底有新生血管长出，FFA检查可见荧光渗漏;OCT检查见脉络膜新生血管处色素上皮层增厚;组织切片HE染色可见视网膜色素上皮层厚度变薄，颜色稍深;视网膜色素上皮已有萎缩，视网膜电流图检查可见波幅明显降低。建模后第1个月，眼底荧光渗漏较第2周时减少，OCT检查见新生血管处色素上皮结构破坏，上方视网膜变薄;视网膜组织切片可见色素上皮层厚度明显减少;视网膜电流图检查基本呈痕迹型。结论 本模型制作方法简单易行，成功率高，同时有明确的视网膜色素上皮萎缩及脉络膜新生血管形成，是比较接近人类年龄相关性黄斑变性特征的动物模型。

　　【关键词】 年龄相关性黄斑变性;动物模型;激光光凝

　　Establishment of a rabbit model for age-related macular degeneration with a drug and lasers

　　ZHAO Chun， LUO Min ， JI Jing， et al.

　　Department of Ophthalmology， the Ninth Affiliated Hospital of Shanghai Jiaotong University， Shanghai China， 200011

　　[Abstract] Objective To use 1% iodine sodium and YAG-532 lasers to establish an animal model of age-related macular degeneration which is close to the clinical condition. Methods Ten healthy adult chinchilla rabbits were selected. Retinal photocoagulation was induced in the left eyes after mydriasis with tropicamid under general anesthesia， then 1% iodine sodium was injected in the vein of the rabbits at a dose of 40 mg/kg at the same time; their right eyes were not treated. Changes in the retina， FFA， ERG， OCT and histological sections were observed after two weeks and one month. Results After two weeks， neovascular growth can be observed and there was obvious fluorescence leakage by FFA. Atrophy of the retinal pigment epithelium could be seen， and there was an obvious reduction in the amplitude of the ERG wave. After one month， fluorescence leakage was reduced in FFA， the RPE structure of the CNV was destroyed in the OCT，the results of the ERG presented with an extinguished wave and a reduction in the thickness of the pigment epithelium could be seen in the retinal specimen. Conclusion The establishment of an animal model is simple and feasible with a high success rate. Only one rabbit died， and the other nine rabbits were healthy. Among them， choroidal neovascularization and retinal pigment epithelial atrophy was definitive. This is the closest animal model to age-related macular degeneration in human beings.

　　[Key words] age-related macular degeneration; animal model; laser photocoagulation

　　年龄相关性黄斑变性(age-related macular disease，AMD)是发达国家老年人群中的首位致盲眼病[1]，其临床和病理特征包括黄斑区脉络膜、Bruch膜和视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)层复合体的病变，玻璃膜疣的产生、色素上皮萎缩、光感受器减少或者丧失、脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)以及视网膜下纤维瘢痕形成，导致中心视力下降或者丧失。随着我国社会人口的老龄化，AMD的发生率也在逐年提高，尤其是经济发达的上海市，致盲眼病的疾病谱正在发生改变，视网膜疾病可能取代白内障等眼病成为首位致盲眼病[2]，AMD尤其是湿性AMD将会是50岁以上人群中一种严重危害视力的眼病。因此，建立理想的动物模型可为进一步研究AMD的发病机制、病理改变及临床治疗提供帮助，对于该病的研究具有非常重要的临床意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 　材料

　　1.1.1 实验动物

　　健康成年无眼病青紫蓝兔10只，体重2.5~3.0 kg，雌雄不分(由上海交通大学医学院动物实验中心提供)。适应性分笼圈养1周，观察其活动情况，双眼跟随反应无异常者纳入实验。

　　1.1.2 药物和试剂

　　美多丽眼液(复方托吡卡胺，参天制药株式会社)，0.4%倍诺喜滴眼液(参天制药株式会社)，10%荧光素钠注射液(广西梧州医药股份有限公司)，1%过碘酸钠溶液(美国sigama公司)，眼球固定液(复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼病理科配制)。

　　1.1.3 仪器

　　YAG-532倍频激光机(美国IRIS公司)，NF-505型荧光眼底血管造影仪(日本Nikon公司)，SPECTRALIS-OCT(德国海德堡公司)，LKC-3000型视觉电生理诊断系统(美国LKC公司)。

　　1.2　 动物模型的制作

　　1.2.1 激光诱导CNV的产生

　　用美多丽眼液对左眼充分散瞳，倍诺喜眼液表面麻醉后在全视网膜镜下用倍频激光(波长532 nm)在视乳头髓线上方光凝24个点(4×6)，光斑间隔50 μm。光凝的激光能量为700 mW，光斑直径75 μm，曝光时间0.1 s。实验动物右眼未作任何处理。

　　1.2.2 药物导致视网膜色素上皮萎缩

　　激光光凝后2 h，将1%过碘酸钠溶液按40 mg/kg的剂量自兔耳缘静脉缓慢注入。

　　1.3 眼部观察

　　1.3.1 眼底检查

　　激光光凝后第14天、第1个月行左眼眼底彩色照相、眼底荧光血管造影(fluoresscence fundus angiography，FFA)检查。FFA检查时麻醉散瞳同前，经兔耳缘静脉注射10%荧光素钠注射液。

　　1.3.2 视觉电生理检查

　　实验动物激光光凝前、光凝后第14天、第1个月，分别行双眼视网膜电流图(electro retinogram，ERG)检查，将动物全身麻醉后安放角膜接触电极，参考电极置于额部正中皮下，接地电极置于双耳后皮下。调整兔眼距屏幕的检测距离为30 cm，暗适应30 min后开始记录。

　　1.3.3 组织病理学检查

　　所有实验动物在观察结束后处死，取下左眼眼球，将角膜缘戳孔后放入眼球固定液中固定，24 h后依次梯度脱水并行HE染色，在光镜下观察视网膜及脉络膜病理变化情况。

　　1.3.4 眼底OCT检查

　　实验动物光凝前、光凝后第14天、第1个月，分别行左眼OCT检查。扫描方式为通过激光光斑处面扫，扫描线段长6 mm，扫描深度870 μm，横向和纵向分辨率均为6 μm/pixel，扫描速度40000 Hz/s。

　　2 结果

　　2.1 一般情况

　　所有实验动物除1例意外死亡外，其余均正常存活， 无眼部感染及其他并发症。注射过碘酸钠溶液2~3 d后，所有动物均出现不同程度的厌食及烦躁，考虑为视力下降所致，未予特殊处理，数日后均自行好转。

　　2.2 眼底改变

　　实验动物光凝时，光斑中央有气泡形成，无出血;光凝及注药后观察眼底见光斑中央为浓白色(见图1)，眼底荧光造影未见荧光渗漏。随时间推移，视网膜色素上皮逐渐萎缩，眼底高荧光较前增强，且光斑处出现荧光渗漏。造模后第14天，眼底荧光造影见激光光斑处显示为高荧光，并有明显荧光素渗漏(见图2)。造模后第1个月，眼底检查可见光斑中央有新生血管长出，但眼底荧光造影仅见激光光斑处有少量荧光渗漏，较第14天时明显减少(见图3)。

　　2.3 视觉电生理改变

　　实验动物光凝及注药前ERG检查显示，a波、b波、ops波各项波型均存在，振幅正常(见图4)。第14天检查显示，ERG的a波、b波波型依然存在，但振幅明显降低，潜伏期延长，左眼由于同时受药物和激光双重作用，波形下降更为明显，ops波已基本消失(见图5)。造模后第1个月，ERG各项波型已基本消失，为痕迹型(见图6)。

　　2.4 组织病理学检查

　　正常兔视网膜组织切片HE染色可见：视网膜色素上皮层厚度正常，颜色呈淡紫色(见图7)。第14天时，模型动物视网膜色素上皮层厚度变薄，颜色稍有加深(见图8)。第1个月时，模型动物视网膜切片可见色素上皮层厚度明显变薄，颜色进一步加深(见图9)。

　　2.5 眼底OCT检查

　　正常兔眼底OCT检查可见视网膜色素上皮层光带完整，未见新生血管(见图10)。造模后第14天，OCT检查可见脉络膜新生血管处色素上皮层增厚，反射信号增强，上方视网膜隆起增厚(见图11)。造模后第1个月，OCT显示新生血管处视网膜色素上皮结构紊乱，反射增强，上方视网膜萎缩变薄(见图12)。

　　3 讨论

　　年龄相关性黄斑变性在临床上分为干性和湿性两型：其中干性又称非渗出性，以黄斑区地图状萎缩为特征;而湿性又称渗出性，以脉络膜新生血管(CNV)形成为特征。本实验联合药物和激光共同作用，旨在构建既存在视网膜色素上皮萎缩又有脉络膜新生血管的动物模型，同时采用眼球大小和视网膜结构都与人近似的青紫兰兔作为动物模型，从而使之尽量符合人类年龄相关性黄斑变性的病理改变。

　　目前，建立CNV动物模型的方法有很多，各有优缺点。如Ccl-2/Ccr-2基因缺失的小鼠诱导的CNV模型与人类年龄相关性黄斑变性的CNV产生的病程、解剖、病理改变非常接近，但该种实验动物需经基因敲除，费用昂贵，且模型成功率较低[3]。采用激光诱导造模的方法被广泛应用。由此方法产生的CNV与人类AMD引起的CNV有很多共同之处。首先，组织来源相同，眼底激光诱导产生的CNV血管内皮细胞同样源于脉络膜毛细血管;其次，病理基础也相同，都是由脉络膜毛细血管-Bruch膜-视网膜色素上皮复合体损伤导致血管生成因子与抑制因子间平衡的破坏，使内皮细胞发生增生、移行和管腔形成等一系列新生血管形成过程[4]。目前较常使用的有氩、氪激光，本实验采用的倍频Nd：YAG激光与氩离子激光作用相似。在一定波长范围内，随着激光波长的增加，其组织穿透能力增加，可更多地作用于脉络膜组织。

　　视网膜色素变性的制作则通常选用过碘酸钠溶液注射，通过静脉注射过碘酸钠可引起视网膜色素上皮萎缩甚至坏死。江伟等[5]研究发现：过碘酸钠诱导的PRE细胞凋亡受剂量和时间的双重影响，视网膜坏死程度与注射后时间及注射量呈正相关。剂量为30～40 mg/kg的过碘酸钠适用于非渗出性年龄相关性黄斑变性的体内造模。本实验采用40 mg/kg的剂量注射，14 d后即可见ERG改变，同时组织病理学切片可见色素上皮萎缩，与文献报道一致。

　　视网膜电流图(ERG)被广泛地应用于眼科临床和动物实验的研究中，其中暗适应ERG为标准化ERG中的一个主要项目，它记录视网膜的最大电反应，为全视网膜视椎和视杆电反应的总和[6]。过碘酸钠是一种选择性作用于视网膜色素上皮层的药物，在本实验动物静脉注射碘酸钠14 d后，ERG的a、b波峰延迟，振幅下降。1个月后，视网膜色素上皮层明显萎缩变薄，导致色素上皮-光感受器复合体严重受损，ERG最终呈痕迹型，进一步验证了视网膜色素上皮变性的病理基础。

　　眼底荧光血管造影(FFA)对诊断视网膜血管疾病和视网膜色素上皮病变具有重要的临床价值[7]。由于FFA能够反映眼底血管形态，揭示病变性质，同时可在同一动物身上多次重复使用从而实现连续动态的观察，因此在AMD的诊断和治疗中具有不可替代的作用。干性AMD的FFA表现为：玻璃膜疣处出现强荧光，且随着玻璃膜疣的增大，延迟出现的强荧光现象越明显。湿性AMD由于新生血管的形成则表现为：早期黄斑部出现典型的CNV轮廓，呈颗粒状、斑片状或车轮状，随后迅速出现荧光渗漏并互相融合，形成边界模糊的强荧光区，后期脉络膜背景荧光消退后该处仍持续呈强荧光[8]。本组动物光凝后行FFA检查示：背景呈高荧光，造模时间越长，背景荧光越亮。光斑有荧光渗漏，随造影时间逐渐扩大并相互融合，形态与人类AMD眼底造影相似。

　　OCT是一种新的、非穿透性的、对视网膜的横切面进行断层扫描的技术，它可以分辨不同形态、性质的病变。对于渗出性的脉络膜新生血管膜，OCT可以对新生血管膜形态进行定量和定性测量，了解新生血管膜的边缘是否清晰，以及是否有色素上皮脱离及视网膜水肿，并可监测新生血管膜的发展[9]。本研究中正常实验动物色素上皮层完整，视网膜结构正常。激光造模后第14天，OCT检查可见新生血管处色素上皮层反射增强，视网膜隆起增厚。随时间推移，上方视网膜萎缩，第1个月时OCT检查可见新生血管处视网膜结构破坏，断面可见激光光斑处视网膜变薄，与眼底荧光造影改变一致。

　　综上所述，年龄相关性黄斑变性病理改变复杂，动物模型多种多样，各有优劣。本实验选择了与人眼大小相似且同样具有视网膜色素上皮的青紫蓝兔作为模型动物，联合1%过碘酸钠和激光共同作用，破坏视网膜色素上皮层，诱导产生新生血管，更加符合老年人黄斑变性的发生机制。该方法制造的动物模型不论从形态上还是从功能上都鉴定到与人类年龄相关性黄斑变性相似的病理改变发生，且动物模型制作过程简单，易重复，实验动物容易获得，成功率高，是比较理想的年龄相关性黄斑变性的动物模型。但是，该研究也存在一定的不足，例如对于1%过碘酸钠和激光均是采取统一用量，没有进行分组量化，目前仍在继续研究中。

　　【参考文献】

　　[1] McCarty CA， Mukesh BN， Fu CL， et al. Risk factors for age-related maculopathy： the visual impairment project[J]. Arch Ophthalmol，2001，119(10)：1455-l462.

　　[2] 邹海东，张皙，许迅，等. 上海市静安区曹家渡街道年龄相关性黄斑变性的患病率调查[J]. 中华眼科杂志，2005，4(1)：15-19.

　　[3] 杨秀梅，王雨生. 脉络膜新生血管的动物模型[J]. 国际眼科纵览，2006，30(3)：166-170.

　　[4] Criswell MH， Ciulla TA， Hill TE， et al. The squirrel monkey： characterization of a new-worn mate model of experimental choroidal neovaseularization and comparison with the macaque[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2004，45(2)：625-634.

　　[5] 江伟，张婉玉，邱春亿. 碘酸钠诱导非渗出型年龄相关性黄斑变性模型的研究[J]. 国际眼科杂志，2008，8(8)：1504-1510.

　　[6] 李海生，潘家普. 视觉电生理的原理与实践[M]. 上海：上海科学普及出版社，2002：113.

　　[7] 文峰. 努力提高眼底血管造影的临床释义水平[J]. 中华眼底病杂志，2000，16(1)：2.

　　[8] Bird AC， Barnes RM. Age-related macular disease：an ongoing challenge[J]. Clin Exp Ophthalmol，2003，31(6)：461-463.

　　[9] 李永，高岩，戴虹，等. 光学相干断层扫描对年龄相关性黄斑变性及脉络膜新生血管膜的诊断意义[J]. 美中国际眼科杂志，2001，1(2)：20-22.