小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎中基质金属蛋白酶-2、8、9阳性细胞计数及意义

　　作者：伍志琴　杨燕宁　邢怡桥　袁静　杨万举 作者单位：434020　湖北省，荆州市中心医院眼科(伍志琴);武汉大学人民医院眼科 湖北省人民医院眼科中心(杨燕宁、邢怡桥、袁静、杨万举)

　　【摘要】 目的　探讨单纯疱疹病毒性角膜炎小鼠角膜中基质金属蛋白酶(MMP)-2、8、9阳性细胞计数、细胞来源及临床意义。方法　建立小鼠单纯疱疹病毒性角膜基质炎(HSK)模型，分别收集正常角膜和感染1型单纯疱疹病毒(HSV-1)后2 d、7 d、14 d的小鼠角膜，行免疫组化染色。在光学显微镜下对免疫组化切片的结果进行分析，观察不同时间点MMP-2、8、9在角膜组织中的定位，并分别统计中央角膜及周边角膜基质中MMP-2、8、9阳性细胞、MMP-2、8、9阳性的中性粒细胞及浸润的中性粒细胞、总细胞的数量，进行统计分析。结果　感染后第2天，上述各细胞表达增加，主要位于浅表基质层及上皮下的炎性细胞，周边角膜组织中的中性粒细胞和MMP-2、8、9阳性细胞数明显高于中央角膜基质中;感染后第7天，MMP-2、8、9及中性粒细胞表达下降;感染后第14天可见中央角膜坏死及角膜溃疡形成，同时角膜基质和浸润的炎性细胞中尤其溃疡处，可见MMP-2、8、9表达显著增加。结论　HSV-1感染角膜后，大量中性粒细胞自角膜缘血管网侵入中央角膜基质。中性粒细胞与角膜细胞释放大量的蛋白水解酶(MMP-2、8、9)，可能在角膜上皮炎、角膜溃疡穿孔、新生血管形成等过程中发挥重要作用。

　　【关键词】 角膜炎,疱疹性,基质金属蛋白酶类,免疫组织化学;　细胞计数

　　【Abstract】　Objective　By established the mouse model of herpes stromal keratitis (HSK)，to study the expression，distribution and clinical significance of matrix metalloproteinases (MMPs)-2,8,9 positive cells in the corneas of HSK.Methods　BALB/c mice infected with herpes simplex virus type-1 (HSV-1，KOS strain) to induce HSK.The infected animals were followed up daily with a silt lamp microscope for the development of HSV-1 keratitis.After different time points (0,2,7,14 days after infection)，the animals were killed.The inoculated eyes were enucleated.The samples were analyzed for the distribution of MMP-2,8,9 by immunohistochemistry.Meanwhile，the MMP-2,8,9 positive cells，MMP-2,8,9 positive neutrophils，neutrophils and total cells per high power filed(450) were counted in the central and peripheral corneas.Results　At day 2 post-infection，MMP-2,8,9 expression were increased in the epithelium as compared to the uninfected control eyes，and were detected in the superficial stroma and in inflammatory cells beneath the epithelium.The neutrophils and MMP-2,8,9 positive cells in the peripheral stroma are more than these in the center stroma.MMP-2,8,9 and neutrophils expression were decreased at day 7 post-infection.Necrotizing keratitis with corneal ulceration was present on days 14 post-infection.This correlated with increased expression of MMP-2,8,9 within the stroma and in infiltrating inflammatory cells.MMP-2,8,9 staining were particularly intense in the proximity of the ulcers.Conclusions　After corneal HSV-1 infection，abundant neutrophils invaded into the stroma cornea through the vascular net of limbus.MMPs produced byinflammatory cells and resident corneal cells play an important role in the pathological process of HSK，possibly promote epithelial keratitis，corneal ulceration and neovascularization after corneal HSV-1 infection.

　　【Key words】　Keratitis，herpetic;　Matrix metalloproteinases;　Immunohistochemistry;　Cell count

　　1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1，HSV-1)感染角膜后引起的单纯疱疹病毒性角膜基质炎(herpes stromal keratitis，HSK)是一种世界范围内常见的感染性眼病。HSK可导致角膜溶解、新生血管形成、角膜溃疡穿孔及瘢痕形成等严重病理改变[1-2]，因此对其发生过程中角膜基质溶解的机制进行研究显得非常有意义。已有研究认为角膜的上述病变与白细胞浸润、组织降解酶[包括基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)]等有关[3-4]。其中MMPs是一种能降解所有纤维状胶原的蛋白酶，在维持细胞外基质(ECM)的生理性更新，调节细胞的黏附、移行等过程中发挥重要作用。

　　本实验主要通过建立小鼠HSK模型并对其进行临床评价，研究MMP-2、8、9阳性细胞计数、细胞来源及它们在HSK中表达的临床意义。

　　材料与方法

　　1. 实验动物： 选用鼠龄为6～8周，体重16～18 g，经眼科检查无任何眼科疾病的雌性BALB/c小鼠 (武汉大学动物中心提供)40只作为实验对象。随机分组，于感染病毒后第0、2、7、14天处死动物取出眼球(每个时间点取10只)，对侧眼作为对照组。

　　2. 主要试剂：兔抗小鼠MMP-2、8、9的特异性多克隆抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)偶联的第二抗体来自美国Santa Cruz生物技术公司;碱性磷酸酶结合的抗蛋白链菌素(StreptABComplex)为德国汉堡DAKO公司产品;DMEM购于Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季青生物公司，病毒HSV-1(KOS毒株)由德国Münster St.Franziskus医院眼科实验室惠赠。

　　3. 动物模型的制备：病毒HSV-1KOS毒株使用前滴度为2×107 pfu/ml。生产和检测病毒的细胞为非洲绿猴肾细胞(Vero cells)。采用速眠新Ⅱ注射液(0.01 ml/g)颈部皮下麻醉小鼠，在显微镜下用1号无菌针头十字交叉划伤小鼠右眼全角膜上皮层后，将5 μl含有1×105 pfu 病毒的DMEM液点于右眼角膜表面滞留10 s，同时轻轻按摩小鼠眼睑。每只小鼠左眼作为对照组，仅划伤角膜上皮层。划伤、感染眼每日以0.5%庆大霉素滴眼液滴眼。每天在裂隙灯显微镜下观察并记录小鼠HSK临床评分。

　　4. 诊断小鼠HSK依据：本研究采用Heiligenhaus等介绍的方法对小鼠HSK角膜上皮病变及角膜基质炎进行诊断并临床评分[3-5]。具体方法为：依据角膜上皮及基质损害的严重程度以0～4+评分。角膜上皮病变计分依据上皮表面病变的面积大小：0为无上皮损伤;1+为上皮损伤面积少于25%;2+为上皮损伤面积大于25%少于50%;3+为上皮损伤面积大于50%少于75%;4+为上皮损伤面积为75%～100%。角膜基质混浊的评分标准为：0为角膜基质清晰透明;1+为角膜基质稍混浊;2+为角膜基质中度混浊，可透见后部虹膜特征;3+为角膜基质重度混浊，但仍可判断瞳孔缘的位置;4+为角膜基质完全混浊，失去了后部特征。角膜新生血管的评分标准为：0为无新生血管长入角膜;1+为新生血管向心性生长，但未达到瞳孔中央或未超过角膜半径;2+为达到瞳孔中央或超过角膜半径。

　　5. 免疫组织化学染色：取出的眼球立即以4%甲醛固定6 h后常规石蜡包埋，5 μm厚切片。分别行MMP-2、8、9免疫染色。免疫组织化学染色具体步骤：常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，过氧化物酶阻断液(3%过氧化氢溶液)，室温下孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶活性，正常非免疫性动物血清染色30 min以封闭非特异性抗原，TBS冲洗3次，滴加一抗 (TBS稀释1∶100)室温孵化过夜，TBS冲洗3次后，滴加二抗孵化1 h。滴加StreptABComplex 反应1 h后，使用底物试剂盒作用30 min，显微镜下控制显色反应时间，苏木精轻度复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。采用TBS代替一抗作阴性对照，阳性结果为细胞质、细胞膜中出现红色颗粒。

　　6. 细胞计数：光镜下观察免疫组织化学染色切片，每张切片随机选择5个400倍视野观察，分别对中央角膜与周边角膜组织中的抗MMP-2、8、9阳性细胞数进行计数，同时计数MMP-2、8、9阳性的中性粒细胞数、中性粒细胞总数、总细胞数，分别以每个高倍镜下阳性细胞均数±标准差(x-±s)表示不同组的阳性细胞个数。

　　7. 统计学分析：对小鼠HSK的临床评分和以上的细胞计数结果均以均数±标准差(x-±s)表示。细胞计数结果与正常对照组相比较，进行t检验，以P<0.05为差异有统计学意义，并利用SPSS 13.0软件进行分析。

　　结　　果

　　1. 不同时间点小鼠HSK的临床评价(表1)：本研究中实验组所选取的30只实验动物是感染HSV-1 2 d后出现典型的上皮单纯疱疹病毒性角膜炎的BALB/c小鼠，在实验第2、7、14天处死前分别进行裂隙灯检查，对上皮损伤的面积、基质混浊程度及新生血管化程度进行评分。发现BALB/c小鼠感染HSV-1后，均出现典型的临床表现，即首先出现角膜上皮炎，约5～7 d后，上皮病变逐渐趋于愈合，但基质的损害逐渐增加，基质炎性浸润、水肿，角膜新生血管形成，并可在14 d左右出现角膜溃疡。典型HSK小鼠第14天外眼像见图1[6]。每只小鼠未感染病毒的对侧眼，仅划伤角膜上皮，几乎全在1～2 d内角膜上皮修复完好。表1　小鼠HSK在不同时间点的临床观察与评分

　　2. 免疫组织化学染色结果：正常角膜组织中，MMP-2、8定位于角膜上皮细胞层，尤其是基底膜部位，而MMP-9弥散于角膜基质层。在小鼠角膜感染HSV-1后第2天，可见角膜组织中尤其是周边角膜组织中中性粒细胞显著增多，MMP-2、8、9的表达较未感染眼增加，且主要位于上皮下的炎性细胞和角膜细胞中。感染后第7天，角膜组织中的MMP-2、8、9的染色较第2天均减弱，表达下降。中央角膜坏死性病变和角膜溃疡形成出现在HSV-1感染后第14天，角膜基质全层特别是基质坏死区、溃疡区及邻近溃疡的上皮细胞中可见MMP-2、8、9阳性染色又显著增加，其中溃疡区大量中性粒细胞浸润，MMP-8染色呈强阳性。明胶酶(MMP-2、9)以及胶原酶MMP-8免疫组织化学结果见图2,3[7]。

　　3. 细胞计数结果：通过计数结果发现，中央和周边角膜组织中MMP-2、8、9阳性细胞数和MMP-2、8、9阳性的中性粒细胞数均在感染HSV-1后第2天即开始上升，第7天略有下降，第14天又显著增加，呈双峰变化。中性粒细胞和总的中性粒细胞数量有相同的变化趋势。感染后早期，周边角膜中浸润的中性粒细胞数明显多于中央角膜基质中，说明角膜感染HSV-1后，大量的中性粒细胞可能自角膜缘血管网侵入角膜基质。在整个病程中，MMP-2、8、9阳性的中性粒细胞数占MMP-2、8、9阳性细胞数的绝大部分，说明MMP-2、8、9除了由角膜细胞合成分泌外，主要由浸润的中性粒细胞分泌。所有实验小鼠的对侧眼仅划伤角膜上皮，一般在2 d内上皮完全愈合，其MMP-2、8、9的表达及细胞计数结果与未感染病毒的小鼠角膜表达类似。结果见图4。

　　讨　　论

　　单纯疱疹病毒性角膜炎常反复发作，迁延不愈，导致角膜新生血管、角膜溃疡穿孔和瘢痕形成，患者视力预后差，甚至有摘除眼球的可能。尽管目前临床上有多种较特异的抗病毒药物，但HSK的治疗仍然是比较棘手的问题[8]，严重威胁着人类的视功能。

　　HSK发病的确切机制目前尚不完全清楚，但临床观察和实验研究证实了HSV-1不仅可以直接导致角膜的感染性破坏，还可以通过迟发性免疫病理反应导致基质型角膜炎的发生，后者在角膜内皮炎和基质水肿中起主要作用，因此认为HSK是一种由病毒及病毒抗原引起的T淋巴细胞介导的免疫病理性疾病，而CD4+ T细胞是介导HSK免疫病理反应的主要免疫介质[2,9] 。在HSK中，角膜基质溶解导致溃疡穿孔以及角膜瘢痕修复，有一个复杂的网络调控机制，而众多的因素如细胞因子、趋化因子、协同刺激分子、环氧化酶等均参与了HSK的调控系统。如果能够找到HSK发病过程中关键性的因素并加以抑制，对其治疗及预后有非常重要的意义。近年来，本课题组通过大量研究得出结论：在HSK的发生发展过程中，除了免疫因素的参与之外，角膜中浸润的大量中性粒细胞及其释放的蛋白水解酶在HSK的病理过程中发挥重要作用[5]。HSV-1感染角膜后，大量炎性细胞自角膜缘血管网侵入角膜基质，有研究表明，感染早期多形核白细胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)是角膜中浸润的主要炎性细胞(约占90%)[3,10-11]，因此中性粒细胞大量浸润是HSK病变过程中的一个显著特征。尽管PMN可以抑制病毒的复制，但它也参与了对角膜组织结构的破坏[3]。PMN可释放大量的蛋白水解酶，降解细胞外基质，造成角膜组织溶解，导致上皮性角膜炎和角膜溃疡的形成。

　　本实验所研究的MMPs即属蛋白水解酶家族，它的主要功能是降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和基底膜成分，参与胚胎发生、组织重塑、损伤修复等一系列正常生理过程，也涉及一些重要疾病的发生，如恶性肿瘤的浸润与转移、类风湿关节炎、牙周病以及角膜疾病等[12]。在角膜疾病中，研究得最多的基质金属蛋白酶是明胶酶和胶原酶，明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B (MMP-9)性质相似，均以非活性酶原形式分泌，有相似的底物特异性，可以降解变性的胶原(明胶)和Ⅳ型胶原，MMP-8是胶原酶的一种，能够降解间质胶原。在角膜炎中MMPs主要由角膜上皮细胞、基质细胞和角膜中浸润的中性粒细胞、巨噬细胞等产生。MMPs表达增加并活化后，可引起角膜组织溶解、溃疡及穿孔[5]。 在本实验中证明了小鼠角膜感染HSV-1后第2天，大量中性粒细胞自周边角膜血管网向中央角膜基质浸润，MMP-2、8、9的表达比未感染眼增加且表达主要位于浅表基质层树枝状损害处的炎性细胞中，提示其表达与病毒的破坏作用直接相关;第7天，MMP-2、8、9的表达水平下降，而此阶段临床表现为病毒复制减少上皮病变逐渐愈合;感染后第14 d可见坏死性角膜炎、角膜新生血管及溃疡形成，这时角膜基质中及浸润的炎性细胞中尤其是溃疡处可见MMP-2、8、9表达量又显著增加。同时本实验发现HSV-1感染后，角膜组织中中性粒细胞浸润数量有相同的变化趋势，即感染后第2天开始上升，第7天略有下降，第14天显著升高。这与国内外学者的研究结果也相一致，Chen等[13]研究发现在HSV-1感染后的角膜中性粒细胞浸润呈现两个波峰变化，早期的峰值出现在感染病毒后48 h内，此与单纯疱疹病毒性角膜上皮炎的出现时间相一致;第2个峰值大约发生在感染后10 d左右，此时无法复制出HSV-1，主要由迟发型超敏反应导致。中性粒细胞和MMP-2、8、9阳性细胞数量变化趋势与HSK的典型临床表现也有一致性。即在HSV-1感染的小鼠模型中，第1天就出现典型的角膜上皮炎症，到第5天炎症逐渐消退，上皮愈合，感染后第10天，出现严重的基质性角膜炎，角膜浸润，基质水肿，角膜新生血管出现于感染后第14天，最终可导致角膜溃疡，推测可能与感染HSV-1 10 d后角膜中性粒细胞浸润第二个高峰的出现相关。而中性粒细胞的第二个高峰直接导致了MMP-2、8、9的合成与释放增多。

　　本研究结果从MMP-2、8、9染色阳性的中性粒细胞在MMP-2、8、9染色阳性的总细胞数中所占的比例来看，可说明MMP-2、8、9主要来自中性粒细胞;从不同时间点HSK的临床评价及MMP-2、8、9的表达分布来看，可推测MMP-2、8、9的表达增加在HSK角膜上皮炎症、基质溃疡、新生血管形成等过程中发挥重要作用。进一步了解MMPs的调控机制，对减少HSK后胶原溶解、抑制溃疡形成、减少角膜血管化、促进角膜修复等将具有十分重要的意义。

　　(本文图片见光盘)

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