翼状胬肉中MMP2，TIMP2和TGFβ1的表达意义

　　作者：罗丽娟,周辉　　作者单位：330006) 中国江西省南昌市，南昌大学研究生院医学部2005级;(330006) 中国江西省南昌市，南昌大学第二附属医院眼科

　　【摘要】目的：探讨MMP2及其抑制剂TIMP2和影响它们作用的TGFβ1在翼状胬肉中的表达及意义。

　　方法：采用Maxvision免疫组化技术检测在20例翼状胬肉和10例正常球结膜中MMP2、TIMP2及TGFβ1的表达，并比较两组中表达的差异。

　　结果：MMP2和TGFβ1在翼状胬肉中的表达的阳性率显著高于正常球结膜中它们的阳性表达率(z= 4.618， 4.376，P<0.01)，而TIMP2在两组中的表达差异无显著性(z=1.319，P>0.05)。经Spearman等级相关检验分析，在翼状胬肉中，MMP2 和TGFβ1的阳性表达率存在正相关(r=0.686，P<0.01);而MMP2和TGFβ1与TIMP2阳性表达率之间无相关(r= 0.410， 0.143，P>0.05)。

　　结论：TGFβ1介导的MMP2和TIMP2表达失衡在翼状胬肉的发生、发展及侵犯角膜过程中发挥着重要的作用。

　　【关键词】 翼状胬肉;基质金属蛋白酶2;金属蛋白酶2组织抑制因子;转化生长因子β1

　　Expression and significance of MMP2，TIMP2 and TGFβ1 in pterygium

　　LiJuan Luo, Hui Zhou

　　Department of Medicine, Grade 2005 of Graduate College, Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China; Department of Ophthalmology, the Second Affiliated Hospital, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

　　Abstract

　　　AIM: To investigate the expression and significance of matrix metalloproteinase2 (MMP2), tissue inhibitor of metalloproteinase2 (TIMP2) and transforming growth factor beta (TGFβ1) in the pterygium.

　　 METHODS: Maxvision immunohistochemical staining was used to detect the expression of MMP2，TIMP2 and TGFβ1 in 20 cases with pterygium and 10 cases with normal conjunctiva.

　　　RESULTS: There was significant difference of expression of MMP2 and TGFβ1 between the pterygium and the normal conjunctiva (z= 4.618, 4.376; P<0.01). But there was no statistic significance for TIMP2 expression (z=1.319; P>0.05). By the Spearman rank correlation test analysis, there was correlation between the expression of MMP2 and TGFβ1 (r=0.686;P<0.01), and there was no correlation between the expression of MMP2 and TIMP2 or between the expression of TGFβ1 and TIMP2 (r= 0.410,  0.143;P>0.05).

　　　CONCLUSION: The imbalance induced by TGFβ1 between the expression of MMP2 and TIMP2 may play a critical role during the occurrence, development and invasion of pterygium.

　　　KEYWORDS: pterygium; matrix metalloproteinase2; tissue inhibitor of metalloproteinase2; transforming growth factor beta1

　　0引言

　　翼状胬肉是睑裂部球结膜纤维血管组织呈三角形膜样增生而侵犯角膜的一种眼表疾病，该疾病于热带及低纬度地区发病率较高，其病因和发病机制还不清楚，普遍认为与紫外线照射、气候干燥、接触粉尘等有关[1]。基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2，MMP2)是降解细胞外基质(ECM)的含锌蛋白质。金属蛋白酶2组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase2，TIMP2)是机体自发产生的特异性抑制MMP2功能的蛋白质。在生理条件下，MMP2和TIMP2之间保持动态平衡，在维持ECM沉积和分解平衡中起重要作用[2]。但在某些病理条件下，MMP2与TIMP2的动态平衡被打破，将导致组织的破坏并致病。近年来研究表明，MMP2和TIMP2在翼状胬肉的发生发展过程中可能发挥一定的作用。我们对翼状胬肉组织中MMP2、TIMP2和影响两者的转化生长因子β1(transforming growth foctor beta1，TGFβ1)的表达进行研究，探讨它们在翼状胬肉发生发展过程中发挥的作用和相互关系。

　　1材料和方法

　　1.1材料 收集我院200706/200711门诊确诊为发生于鼻侧的原发性进行期翼状胬肉，且患者同意并行手术切除的翼状胬肉组织20例，男11例11眼，女9例9眼;年龄27～75(平均54.8)岁，病程1～10a。术中完整切除翼状胬肉头部和颈体部。标本置于40g/L中性甲醛中固定48h，后行常规石蜡包埋。另正常球结膜10例，取自因外伤在我院同意并行眼内容物剜出术患者的球结膜组织10例。男7例7眼，女3例3眼;年龄26～68(平均37.2)岁。

　　翼状胬肉上皮中MMP2的表达(Maxvision×400);B：正常球结膜(Maxvision×400)

　　翼状胬肉上皮中TIMP2的表达(Maxvision×400);B：正常球结膜(Maxvision×400)

　　翼状胬肉上皮中TGFβ1的表达(Maxvision×400);B：正常球结膜(Maxvision×400)

　　标本置于40g/L中性甲醛中固定48h，后行常规石蜡包埋。所有病例术前均排除其他角膜及结膜疾病。

　　1.2方法 取组织蜡块制成3～5μm的切片。兔抗人MMP2，TIMP2和TGFβ1多克隆抗体，及Maxvision免疫组化试剂盒均购自福州迈新公司。免疫组化步骤按Maxvision法操作，以PBS代替一抗作为阴性对照，阳性对照由福州迈新公司赠送的标准阳性对照片。细胞内有呈棕黄色颗粒的为阳性细胞。参考Frank等[3]提出的半定量高倍镜下计数1000个细胞，将细胞百分率和染色强度分别计分：阳性细胞百分率0～4%为0分;5%～25%为1分;26%～50%为2分;51%～75%为3分;76%～100%为4分。阳性细胞染色强度，无染色为0分;淡棕黄色为1分;棕黄色为2分;深棕黄色为3分。将两者分数相加为组织总分,0分为阴性();1～2分为弱阳性(+);3～5分为阳性(++);6～7分为强阳性(+++)。

　　统计学处理：两组间率的比较采用秩和检验，两两指标间阳性表达率相关性采用Spearman等级相关检验。以P<0.05为差异有显著性。

　　2结果

　　2.1 MMP2的表达 翼状胬肉中可见棕黄色颗粒分布于上皮层及上皮下纤维层细胞胞浆中，以上皮层最显著;表明MMP2在翼状胬肉中的明显表达。而在正常球结膜中未见棕黄色颗粒，提示MMP2无明显表达。经统计学分析，MMP2在翼状胬肉中阳性表达明显高于其在正常球结膜中的阳性表达，差异有显著性意义(z=4.618，P<0.01)。TIMP2的表达在翼状胬肉中可见棕黄色颗粒弥散分布于上皮层细胞胞浆中;在正常球结膜中也可见棕黄色颗粒分布上皮层细胞胞浆中，表明TIMP2在翼状胬肉及正常球结膜中均呈阳性表达。经统计学分析，TIMP2在翼状胬肉中阳性表达与其在正常球结膜中的阳性表达差异无显著性意义(z=1.319，P>0.05)。

　　2.2 TGFβ1在翼状胬肉及其在正常球结膜中的表达 翼状胬肉中可见棕黄色颗粒广泛分布于上皮层、上皮下纤维层及血管内皮细胞胞浆中，以上皮层最显著;表明TGFβ1在翼状胬肉中的明显表达。而在正常球结膜中可见少数上皮细胞呈淡棕黄色染色，提示TGFβ1有少量表达。经统计学分析，TGFβ1在翼状胬肉中阳性表达明显高于其在正常球结膜中的阳性表达，差异有显著性意义(z= 4.376，P<0.01)。

　　2.3 MMP2，TIMP2和TGFβ1表达的比较 MMP2和TGFβ1在翼状胬肉及其在正常球结膜中的表达，差异均有显著意义(P<0.01)。而TIMP2在两组中的表达差异无显著意义(P>0.05)。经Spearman等级相关检验分析，在翼状胬肉组织中，MMP2和TGFβ1的阳性表达率存在正相关(r=0.686，P<0.01);而MMP2和TGFβ1与TIMP2阳性表达率之间无相关(r=0.410，0.143，P>0.05)。

　　翼状胬肉及其在正常球结膜中MMP2，TIMP2和TGFβ1表达分布

　　3讨论

　　翼状胬肉是一种常见的眼表疾病，手术是主要的治疗方式，但术后复发率较高。有关翼状胬肉发病机制众说纷纭如：免疫学机制、角膜缘干细胞移行机制、细胞调亡与增生异常机制及基质金属蛋白酶作用机制等。翼状胬肉是角膜缘干细胞起源的炎性增生[4]，其病理学特征主要为上皮层及基质浅层成纤维细胞增殖，同时伴有新生血管形成及炎性细胞浸润，以及球结膜上皮细胞的异常增殖[5]。超微结构研究表明，弹性纤维与胶原纤维的增生和变性及基质退变是翼状胬肉较为突出的病理改变[6]。

　　MMP2主要降解明胶、Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原和弹性蛋白。它是由结缔组织细胞以非活性酶原形式分泌，其活化取决于膜型基质降解酶(MTMMP)和TIMP形成的复合物[7]。当TIMP2过量时，就可减少细胞中游离的MTMMP含量，致使MMP2酶原无法活化;而当TIMP2量少时，导致细胞中游离的MTMMP增加，可使MMP2酶原活化增加。在生理条件下，MMP2和TIMP2之间保持动态平衡，但在某些病理条件下，MMP2与TIMP2的动态平衡被打破，将导致组织的破坏并致病。本实验研究表明，MMP2在翼状胬肉的上皮和上皮下基质均有表达，尤其在基底上皮细胞层呈强阳性表达。而在正常球结膜中未见MMP2的表达。这与Dushku等[8]的实验结果一致。TIMP2在翼状胬肉和在正常球结膜中的表达差异无显著意义，提示在翼状胬肉中MMP2和TIMP2的比例失衡。TIMP2量相对少，使MMP2酶原活化增加。而MMP2通过降解明胶、Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原和弹性蛋白，促进ECM的退变，从而改变了细胞赖以生存的微环境，导致细胞生长紊乱和弹性纤维、胶原纤维的异常增生。MMP2还可以促进血管周围的胶原酶活性并降解血管周围的基质，使血管内皮细胞沿着降解的基质向血管生成因子的方向移动，从而促进翼状胬肉新生血管形成。一旦MMP2和TIMP2之间的动态平衡被打破，MMP2异常分泌增加，而TIMP2不会随之增加，可使病变进一步发展。MMP2能裂解角膜前弹力层纤维原蛋白，导致上皮细胞尤其是变性的基底部角膜缘上皮细胞，突破Bowman膜[9]。Bowman膜是角膜上皮和基质层的自然屏障。一旦Bowman膜遭到破坏，翼状胬肉将向角膜侵犯和生长。因此，MMP2和TIMP2在翼状胬肉中的表达失衡，对翼状胬肉的发生、发展及侵犯角膜起着重要的作用。

　　转化生长因子β家族是一组调节细胞生长和分化的蛋白质家族。在哺乳动物中至少发现有4个：TGFβ1，TGFβ2，TGFβ3，TGFβ1β2，其中在眼表组织中以TGFβ1表达为主。TGFβ1在炎症、组织修复、胚胎发育、细胞生长、分化和免疫功能中都起重要的调节作用。它对间充质起源的细胞起激活作用，而对上皮或神经外胚层来源的细胞起抑制作用[10]。我们发现，在翼状胬肉上皮层、上皮下纤维层及血管内皮细胞胞浆中见的TGFβ1表达，以上皮层最显著。而在正常球结膜中极少数上皮细胞见的TGFβ1表达，两者阳性表达差异有显著意义。说明TGFβ1在翼状胬肉的发病过程中起着一定的作用。翼状胬肉常表现为慢性炎症反应，TGFβ1可趋化中性粒细胞到炎症反应部位，促使胞浆内游离的钙离子浓度升高及胞质的48kDa蛋白磷酸化。同时中性粒细胞可产生多种活性物质如氧自由基、白三烯和蛋白水解酶(如IL1、血小板原性生长因子，胶原酶，强性蛋白酶等)，从而导致弹性纤维及胶原纤维变性[11]。TGFβ1还能抑制ECM蛋白水解酶合成，从而抑制ECM分解，导致翼状胬肉中胶原纤维和弹性纤维异常增生和堆积。

　　翼状胬肉的发生是多因素参与复杂过程，各类因子之间形成一个复杂的网络来调节翼状胬肉的发生发展，每个因子不是孤立的发挥作用，而是同其他因子之间存在千丝万缕的联系。本研究结果显示MMP2和TGFβ1的阳性表达率呈正相关，而MMP2和TGFβ1与TIMP2阳性表达率之间无相关。Seomun等[12]的研究表明MMP2的过量表达仅由TGFβ1所诱导。而TGFβ1诱导的细胞与ECM之间的相互作用又是通过调节MMP2的转录来实现的[13]。因此，可以说在翼状胬肉的发生发展过程中MMP2和TGFβ1之间是相互促进、互为因果的。至于TIMP2不随MMP2和TGFβ1表达增加而增加，可能是由于TIMP2对MMP2的特异性抑制作用只是在某个范围内，当MMP2增加超过了最高限度时，两者的动态平衡将被打破，之后TIMP2不能随MMP2的增加而增加，造成细胞中游离的MTMMP增加，使MMP2酶原活化增加，进一步促进MMP2增加，引起ECM的退变和弹性纤维及胶原纤维的异常增生及新生血管的形成，最终导致翼状胬肉的发生发展并侵犯角膜。这些都有待于进一步研究。

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　　12 Seomun Y, Kim J, Lee EH, et al. Overexpression of matrix metalloproteinase2 mediates phenotypic transformation of lens epithelial cells. Biochem2001;358:4148

　　13 Tamiya S, Wormstone IM, Marcantonio JM. Induction of matrix metalloproteinases 2 and 9 following stress to the lens. Exp Eye Res2000;71:591597