老年黄斑变性脉络膜新生血管膜的增殖活性

　　作者：李亚萍,王玲,苏冠方,孙大军,刘早霞　　作者单位：吉林大学第二医院眼科医院,吉林 长春 130041

　　【摘要】目的 研究老年黄斑变性(AMD)脉络膜新生血管膜(CNVM)的增殖活性。方法 22例AMD病人的CNVM，用免疫组化的方法分析增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞核因子(NFκB)、cfos在CNVM中的表达。结果 活动期CNVM的血管内皮细胞与消退期、静止期CNVM的血管内皮细胞对比，PCNA、NFκB、cfos均有较高的表达;在静止期CNVM的血管内皮细胞PCNA、NFκB、cfos无表达或表达较少(P<0.01)。消退期CNVM的色素细胞与活动期、静止期CNVM的色素细胞对比，PCNA、NFκB、cfos均有较高的表达(P<0.01)。消退期CNVM的巨噬细胞与活动期、静止期CNVM的巨噬细胞对比，PCNA、NFκB、cfos均有较高的表达(P<0.01)。静止期CNVM的成纤维细胞与活动期、消退期CNVM的成纤维细胞对比，PCNA、NFκB、cfos均有较高的表达(P<0.01)。结论 细胞增殖活性的细胞核内基因PCNA、NFκB、cfos的表达与CNVM的病理分期(活动期、消退期、静止期)具有明显的相关性。

　　【关键词】 老年黄斑变性;脉络膜新生血管膜(CNVM);CNV的增殖活性

　　我们早期根据渗出性黄斑变性(AMD)的脉络膜吲哚青绿造影(ICGA)与组织病理学特点将脉络膜新生血管膜(CNVM)分为：活动期、消退期、静止期〔1〕。此分期主要依赖于新生血管的数量、成熟程度、色素细胞的包裹、纤维组织和慢性炎性细胞的多少。为了进一步探讨血管内皮细胞、色素性细胞、成纤维细胞、和慢性炎性细胞的增殖活性与CNVM分期的关系，本研究检测细胞增殖核抗原(PCNA)、细胞核因子(NFκB)、cfos在CNVM中的表达，研究以上各因子的表达与CNVM的发生、发展、退化的相关性，并进一步探讨各因子的表达与CNVM分期的关系。此方面研究国际上未见报道。

　　1 材料与方法

　　1.1 资料 2001～2008年，我院确诊的渗出性AMD患者22例22只眼，患者年龄54～81岁，平均年龄67.9岁;男16例，女性6例。视力范围：指数/30 cm～0.4。行ICGA检查将CNV分期〔1〕：活动期9例;消退期9例;静止期4例。行玻璃体切割术联合视网膜下CNVM取出手术。术中获取的CNVM标本进行病理学检查。

　　1.2 主要试剂 增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体、NFκB单克隆抗体、cfos单克隆抗体、兔抗鼠、羊抗兔二抗、SPAP染色剂、San NBTBCIP显色剂，均为Santa Cruz产品，购自北京中山生物公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 免疫组织化学方法 光学显微镜观察免疫组化标本。

　　1.3.2 结果判定 PCNA、NFκB、cfos染色阳性的标准：细胞核染成紫蓝色或淡蓝色为阳性反应细胞。分别选取每张片上的血管内皮细胞、色素细胞、成纤维细胞和慢性炎性细胞观察，按阳性细胞占每类细胞的比例分3级：未见阳性细胞为(-)，阳性细胞<25%为(+)，25%～50%为()，>50%为()。阴性对照用小鼠血清代替Ⅰ抗。

　　1.3.3 分组 分活动期、消退期和静止期CNVM。

　　1.4 统计学分析方法 采用SAS软件进行秩和检验。

　　2 结 果

　　PCNA、NFκB、cfos的表达 活动期CNVM的血管内皮细胞与消退期、静止期相比，PCNA、NFκB、cfos均有较高的表达，在静止期CNVM的血管内皮细胞PCNA、NFκB、cfos无表达或表达较少，差异显著(P<0.01)。消退期CNVM的色素细胞与活动期、静止期相比，PCNA、NFκB、cfos均有较高的表达，差异显著(P<0.01)。消退期CNVM的巨噬细胞与活动期、静止期相比，PCNA、NFκB、cfos均有较高的表达，差异显著(P<0.01)。静止期CNVM的成纤维细胞与活动期、消退期相比，PCNA、NFκB、cfos均有较高的表达，差异显著(P<0.01)，PCNA、NFκB、cfos在血管内皮细胞中的表达 PCNA、NFκB、cfos在色素性细胞中的表达(n) PCNA、NFκB、cfos在巨噬细胞中的表达表4 PCNA、NFκB、cfos在成纤维细胞中的表达

　　3 讨 论

　　PCNA是近年来发现聚积在S期复制细胞核内的细胞周期依赖性蛋白，研究表明，PCNA作为DNA聚合酶δ的辅助因子直接参与细胞增殖过程中的DNA复制，其含量和表达反映细胞的增殖活性,被认为是反映细胞增殖的良好标记物〔2〕。

　　NFκB是多能的转录因子，多基因调控蛋白，在未受刺激或静止期细胞中，以p50/p65蛋白二聚体形式存在，与抑制性胞浆IκB蛋白结合。当细胞受到诱导剂如白细胞介素1(IL1)、肿瘤坏死因子(TNFα)等作用时，可激活NFκB，调节cfos、cmyc等的表达。最近研究指出NFκB在血管内皮细胞的激活中起重要的作用，并参与了视网膜新生血管的形成。NFκB能诱导IL8家族中的CINC在视网膜神经细胞和内皮细胞中表达增加，CINC具有刺激新生血管的形成的作用。NFκB还可诱导血管内皮生长因子(VEGF)的表达。因此，NFκB是细胞受刺激，早期增殖的转录因子〔3，4〕。

　　cfos是癌基因的一种，含有5个外显子，其3'末端非编码区的缺失，可使cfos激活。cfos与另一原癌基因(cjun)的产物JUN通过“亮氨酸拉链”形成异源二聚体FOS/JUN，即转录因子AP1，定位于细胞核内，并与染色质DNA结合，提示其功能可能涉及DNA复制和转录的调节，与细胞的增殖、分化有关。当细胞膜上发生激素、生长因子、有丝分裂原与相应受体相互作用，或在发生膜的去极化和离子通道变化时，引发细胞核内基因的激活。cfos是即刻早期基因，它的转录是膜信号通过第二信使(Ca2+、IP3、DG、CAMP)修饰转录因子，使之活化并转位到细胞核内，与特定的增强子序列结合，促进cfos基因转录，其表达产物FOS蛋白又使种种晚期基因激活，通过后者表达产物而发挥生理作用。

　　本研究发现，活动期CNVM的血管内皮细胞与消退期、静止期相比，PCNA、NFκB、cfos均有较高的表达，在静止期CNVM血管内皮细胞无表达或表达较少。消退期CNVM的色素细胞与活动期、静止期相比，PCNA、NFκB、cfos均有较高的表达。消退期CNVM的巨噬细胞与活动期、静止期相比，PCNA、NFκB、cfos均有较高的表达。静止期CNVM的成纤维细胞与活动期、消退期相比，均有较高。

　　血管内皮细胞核内PCNA、NFκB、cfos的高表达，说明细胞正处于旺盛的增殖状态。因此，我们把含有大量处于这种增殖活性的血管内皮细胞的CNVM命名为活动期。而含血管内皮细胞较少，增殖状态的血管内皮细胞更少的CNVM，提示增殖活性较弱，CNV正在消退。而且CNVM被大量的色素细胞包裹，色素细胞内PCNA、NFκB、cfos的高表达提示色素细胞正处于活跃增殖状态，包围CNV，局限CNV的发展。如果CNV是一个具有开始、维持、退化期的系列化动态发展过程，那么巨噬细胞有什么作用?有一个实验性的证据是巨噬细胞产生肿瘤坏死因子α，它可刺激延长进化过程的维持期。噬细胞克隆RPE产生蛋白质1和巨噬细胞克隆蛋白启动子，将单核细胞移至血管内并黏连，从而延长进化过程的维持期〔5，6〕。所以我们命名此期为消退期。另外，几乎不含新生血管、色素细胞，含有大量的纤维组织，可见成纤维细胞核内有PCNA、NFκB、cfos较高的表达的CNVM，我们分类它为静止期。纵上所述，代表细胞增殖活性的细胞核内基因PCNA、NFκB、cfos与CNVM的病理分期具有明显的相关性。

　　【参考文献】

　　1 李亚萍，黎晓新，张晓光，等.渗出性老年性黄斑变性脉络膜新生血管的吲哚青绿血管造影与组织病理变化的相关性研究〔J〕.中华眼底病杂志;2004;3;20(2)：6972.

　　2 Hall PA，Mercer WE，Shields MT.Proliferating cell nuclear antigen(PCNA) immunolocaliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasms〔J〕.J Phathol，1990;160：28591.

　　3 Ma W，Lee SE，Guo J,et al.RAGE ligand upregulation of VEGF secretion in ARPE19 cells〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2007;48(3):135561.

　　4 Rzymski T，Paantjens A，Bod J,et al.Multiple pathways are involved in the anoxia response of SKIP3 including HuRregulated RNA stability，NFkappaB and ATF4〔J〕.Oncogene，2008;27(33):453243.

　　5 Biam ZM，Elner SG，Streiter RM,et al.IL4 potentiates IL1βand TNFαstimulated IL8 and MCP1 protein production in human retinal pigment epithelial cells〔J〕.Curr Eye Res，1999;18：34957.

　　6 Gerszten RE，GaciaZapeda EA，Lim YC,et al.MCP1 and IL8 trigger firm adhesion of monocytes to vascular endothelium under flow contions〔J〕.Nature，1999;398:71823.