CFH Y402H多态性与新生血管性年龄相关性黄斑变性的相关性

　　作者：季翔,曲毅　　作者单位：青岛大学医学院，山东 青岛 266021

　　【摘要】目的探讨补体因子H(CFH) Y402H多态性与新生血管性年龄相关性黄斑变性(AMD)的相关性。方法 选取山东大学齐鲁医院眼科新生血管性AMD患者100例及与其年龄匹配的健康人100例作为对照，收集外周血，提取基因组DNA，采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCRRFLP)技术，分析CFH Y402H多态性在两组的分布频率，Y402H多态性表现为CFH基因的外显子9的核苷酸1277碱基T突变为碱基C。采用χ2检验计算CFH多态性与AMD的相关性。结果 风险等位基因1277C在两组的频率分别为14.0%和5.0% (χ2=9.42，P<0.05)，病例组的突变纯合子显著增加，两组差异有统计学意义(χ2=9.08，P<0.05)。结论 CFH Y402H多态性与新生血管性AMD相关，且表现出明显的人种差异。

　　【关键词】 补体因子H;多态现象(遗传学);年龄相关性黄斑变性

　　JI Xiang1, QU Yi2

　　(1. Medical College of Qingdao University, Qingdao 266021, Shandong, China;

　　2. Department of Ophthalmology, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China)

　　To investigate the association between Y402H, in the complement factor H gene (CFH) and neovascular agerelated macular degeneration (AMD). Methods 100 patients with neovascular AMD and 100 agematched healthy controls in the clinic of Qilu Hospital were enrolled in this study. Genomic DNA from whole blood was extracted. The Y402H polymorphism in CFH was determined by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism analysis (PCRRFLP). The Y402H polymorphism in CFH showed a substitution of T to C at nucleotide position 1277 in exon 9. The association between genetic polymorphism and disease was examined by χ2 test and logistic regression. Results The frequency of the risk allele 1277C was 14.0% in AMD patients compared with 5.0% in the controls (χ2=9.42，P<0.05)， mutational homozygote 1277CC in AMD cases was higher than that in the controls(χ2=9.08，P<0.05), and the difference between the two groups was statistically significant. Conclusion The Y402H polymorphism in CFH is significantly associated with neovascular AMD and has an ethnic variation.

　　Key words: Complement factor H; Polymorphism(Genetics); Agerelated macular degeneration

　　已知是多个遗传学和环境危险因素相互作用的结果[2]。位于染色体1q31的补体因子H (complement factor H, CFH)具备编码变量的多态性Y402H使白种人AMD的患病风险显著增加[3]，但亚裔人群的研究结果未发现二者的相关性[4]。本研究旨在通过病例对照研究对新生血管性AMD患者与Y402H多态性的关系进行探讨，分析Y402H多态性的人种差异。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象 ①病例组：新生血管性AMD患者100例来自山东大学齐鲁医院眼科门诊就诊病例，男69例，女31例，平均年龄(68.97±9.87)岁。AMD分型根据年龄相关性黄斑病变和黄斑变性的国际分类标准[5]。入选标准：年龄50岁或以上;单眼或双眼诊为AMD，包括经典型或隐匿型新生血管膜、浆液性或出血性视网膜色素上皮(RPE)脱离和纤维血管性盘状变性;排除其他视网膜脉络膜疾病，如血管样条纹症，高度近视，中心性浆液性视网膜脉络膜病变和假性眼组织胞浆菌病;②对照组：100例健康人对照来自于同期本院健康查体中心，男63例，女37例，平均(70.78±7.94)岁。排除肾功能不全、血液疾病、良性或恶性肿瘤及糖尿病。由同一医师对所有受检者进行全面眼科检查，包括裂隙灯和间接眼底镜检查，对AMD患者行光学相干断层扫描、彩色眼底照相、眼底荧光血管造影和/或吲哚青绿脉络膜造影，详细记录饮食习惯、是否有AMD家族史、全身情况、生活方式，包括吸烟史。所有受检者均要求为汉族，祖籍山东，在济南居住超过10年。本研究经本院伦理学委员会批准并符合赫尔辛基宣言的规定，所有受检者完全了解本研究的目的、步骤和方法，并签署知情同意书。

　　1.2 方法

　　1.2.1 标本采集及基因组DNA抽提 采集研究对象空腹外周血2?mL，枸橼酸钠防凝，DNA抽提试剂盒(Qiagen公司)提取全基因组DNA，-20?℃保存待用。

　　1.2.2 基因多态性分析 采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCRRFLP)，由济南博亚生物技术有限公司合成CFH Y402H (rs1061170)寡核苷酸引物,序列为：上游引物：5′TCA TTG TTA TGG TCC TTA GGA AA3′，下游引物：5′ TTA GAA AGA CAT GAA CAT GCT AGG3′。PCR反应体系为50?μL，包括10?mmol TrisHCl (pH 8.0), 50?mmol KCl, 0.1% Triton X100, 2?mmol MgCl2, 0.2?mmol dNTP, 100?pmol引物和1U Taq DNA聚合酶，扩增条件为：95?℃预变性3?min，94?℃变性30?s, 58?℃退火30?s，72?℃延伸45?s，共35个循环。PCR产物由限制性内切酶Tsp509I特异性识别等位基因T，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，以DNA Marker做参照，紫外灯下观察结果。为验证PCRRFLP结果，在两组分别选取每一种基因型的PCR产物进行测序。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计分析软件.

　　2 结 果

　　2.1 研究对象的人口学特点 两组的年龄和性别构成差异均无统计学意义(P>0.05)，两组的年龄和性别均匹配。

　　2.2 CFH Y402H 基因型及等位基因频率分析 CFH Y402H rs1061170基因序列的扩增产物全长为241?bp，经限制性内切酶Tsp509I酶切后，野生型(TT型)产生181、60?bp两个片段，突变杂合子(TC型)产生241、181和60?bp　3个片段，突变纯合子(CC)带型为241?bp。测序结果与基因库序列完全一致。两组CFH Y402H rs1061170基因型频率分布差异有统计学意义(χ2=9.08，P<0.05)，病例组C等位基因频率为14%，对照组为5.0%，两组比较差异有统计学意义(χ2=9.42，P<0.05)。两组人群基因型分布经χ2检验均符合HardyWeinberg平衡(病例组：χ2=0.75，P>0.05;对照组：χ2=2.49，P>0.05)，具有遗传代表性。

　　3 讨 论

　　流行病学研究显示，北京40岁以上2.0%的低视力和7.7%的失明患者是由AMD造成[6]，随着老龄化加速，AMD的危害越来越受到重视。

　　家系和双生子的研究发现AMD具有多基因遗传性，基于白种人群的病例对照研究表明[7]，CFH基因的外显子9的核苷酸1277碱基T突变为碱基C，使蛋白质的第402位编码子酪氨酸突变为组氨酸，即Y402H，从而使AMD患病风险升高。已知炎症反应在AMD发病机制中扮演了重要角色[8]。CFH是选择性补体通路的调节因子，是由20个短重复序列，每个序列由60个氨基酸组成的150?kD的血清蛋白质。CFH选择性阻断C3活化为C3b，并降解C3b。CFH与C反应蛋白 (CRP)的结合位点位于包含Y402H多态性的域，CRP是炎性反应的生物学标记，Y402H等位基因可能改变CFH的CRP结合特性，不能有效抑制C3向C3a和C3b的转化，导致膜攻击复合物形成，从而形成AMD。

　　AMD组和对照组的风险等位基因1277C的频率在韩国人分别为10.5%和6.5%[9]，香港人为5.8%和3.9%[10]，明显低于白种人的55.9%～59.0%和35.4%～39.9%[11]，与国际HapMap计划报告亚裔健康人等位基因1277C(日本人8.1%，中国人6.8%)的频率接近[12]，且Y402H多态性与本研究两组人群的新生血管性AMD的易感性不相关，与日本人群的研究结果相似，认为是其它变量作用于病变的进展。本研究中等位基因1277C的频率，病例组明显高于对照组(χ2=9.42，P<0.05)，健康人对照组等位基因1277C的频率与国际HapMap计划的差别可能由于采样人群不同所造成。

　　本研究结果表明，病例组突变纯合子和突变杂合子明显多于对照组(χ2=9.08，P<0.05)，表现为CFH基因的Y402H多态性与新生血管性AMD显著相关。台湾学者报告[13]，AMD病例组和对照组等位基因1277C的频率分别是11.3%和2.8%，结论与本研究相同，但不同于本研究的是，其对照组表现为HardyWeinberg平衡，而病例组出现平衡偏移，进一步证实Y402H多态性的人种差异。

　　亚裔人群中日本人、韩国人和中国人的基因背景相似，等位基因1277C的频率接近，Y402H多态性与AMD的易感性的相关性不同，除人种差异外，可能还有其他相关因素协同作用。

　　综上所述，新生血管性AMD的易感性与CFH基因的Y402H多态性显著相关，且表现出明显的人种差异，这种差异与AMD发病机制的关系尚有待进一步研究。

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