基质金属蛋白酶抑制剂对高氧诱导的小鼠视网膜色素上皮衍生因子的影响

　　作者：王绍飞,任兵,郭继华,李文静,高晓唯　　作者单位：832002)中国新疆维吾尔自治区石河子市，石河子大学医学院;(830011)中国新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，解放军474医院全军眼科中心

　【摘要】目的:通过高氧诱导的小鼠视网膜新生血管动物模型玻璃体内注入GM6001观察对视网膜PEDF表达的影响。

　　方法:选取鼠龄为7d的SPF级C57BL/6J小鼠48只(96眼),随机分为4组:正常组、高氧组、GM6001干预组和磷酸盐缓冲液对照组,每组12只。正常对照组鼠在正常空气环境中饲养,其余3组鼠置于氧箱中,建立高氧诱导的视网膜新生血管动物模型。在出生后第12d GM6001干预组幼鼠向玻璃体腔内注射GM6001 1μL(100μmol/L),而磷酸盐缓冲液对照组注射相同体积的磷酸盐缓冲液，正常组和高氧组不做处理。各组小鼠均在出生后第17d处死。摘除左眼球制作石蜡标本,分别用抗色素上皮衍生因子 (PEDF)和抗CD34抗体作免疫组织化学标记视网膜切片进行组织病理学观察;右眼剥离视网膜提取蛋白，采用ELISA法分析PEDF以及基质金属蛋白酶(MMPS)在视网膜中的含量。

　　结果:17d龄时，正常组和GM6001组小鼠在视网膜各层可见PEDF阳性表达产物，其中以神经节细胞层及神经纤维层表达为著，为高表达，对照组与高氧组小鼠，17d龄时表达显著减少，只在神经节细胞层有较高表达，其余各层表达极少见。MMP2，MMP9，PEDF的含量GM6001组和PBS对照组及高氧组之间在统计学上均有差异P<0.01 GM6001组和正常组之间没有统计学差异P>0.05，高氧组和PBS对照组没有统计学差异P>0.05。

　　结论:玻璃体内注入一定剂量的GM6001通过抑制基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9能够有效增强高氧诱导下的小鼠视网膜PEDF的表达并使新生血管的增长受到抑制。

　　【关键词】 PEDF;MMP2;MMP9

　　A pilot study of MMP inhibitors on the pigment epitheliumderived factor in mouse retinal in a high oxygeninduced environment

　　ShaoFei Wang, Bing Ren, JiHua Guo, WenJing Li, XiaoWei Gao, FengLan Wang

　　Department of Ophthalmology, Medical College of Shihezi University, Shihezi 832002, Sinkiang Uyghur Autonomous Region, China; Ophthalmic Center, No.474 Hospital of Chinese PLA, Urumqi 830011, Sinkiang Uyghur Autonmous Region, China

　　Abstract

　　　AIM: To observe the expression of pigment epitheliumderived factor (PEDF) in the retina of mice by high oxygeninduced retinal neovascularization with injecting GM6001 in vitreous cavity.

　　　METHODS: Fortyeight C57BL/6J mice (96 eyes) aged 7 days in SPF were randomly divided into four groups: normal group, highoxygen group, GM6001 intervention group and phosphate buffer control group, with 12 mice in each. The normal group was fed in normal air, and the three groups were placed in oxygen boxes to establish high oxygeninduced retinal neovascularization animal models. at 12 days after birth, GM6001 intervention group was injected GM6001 1μL into the vitreous cavity, and phosphate buffer control group was injected with the same volume of phosphate buffer. No management was done on Normal or highoxygen groups. The mice were executed at 17 days after birth. Their left eyes were removed for specimens, and antiPEDF and antiCD34 antibodies were used respectively for immunohistochemical biopsy pathology observation. Retinal tissue protein was extracted from their right eyes to analyzing the content of MMP2, MMP9 and PEDF in the retina with ELISA.

　　　RESULTS: In normal and GM6001 group, at 17dayold, PEDF positive expression was appeared in every retinal layer, especially in ganglion cells and nerve fiber layer. In highoxygen and control group, at 17dayold, PEDF expressed a significant reduction, only a higher expression in the ganglion cells and nerve fiber layer. At the remaining floors, the expression could rarely be seen. The expression of MMP2, MMP9 and PEDF was statistically significant in GM6001,PBS control and highoxygen group (P<0.01). That in GM6001 and normal group had no statistical signify (P>0.05). And in high-oxygen and PBS control group, the expression of MMP2, MMP9 and PEDF was not statistical significant (P>0.05)

　　　CONCLUSION: In the oxygeninduced retinopathy in mice,injection of GM6001 1 μLl into the vitreous cavity can inhibit MMP2 and MMP9, effectively strengthen the expression of PEDF, and inhibit the growth of neovascularization.

　　　KEYWORDS: pigment epitheliumderived factor; MMP2; MMP9

　　0引言

　　1989年，TombranTink等人从胎儿视网膜色素上皮细胞培养液中最初分离出PEDF，此后在人和鼠中克隆和纯化。PEDF属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor, Serpin)基因家族，但不具备抗蛋白酶活性。具有很强的抑制血管的作用，可能是维持角膜，玻璃体等眼内组织无血管形成的主要原因，在玻璃体内是主要的血管增生抑制剂。最近的研究表明MMP2和MMP9可以水解PEDF这为转录后PEDF的下降和低氧诱导的VEGF/PEDF比率的升高提供了一条新的解释。本研究通过高氧诱导的小鼠视网膜新生血管建立相对缺氧动物的模型。证明基质金属蛋白酶抑制剂通过抑制基质金属蛋白酶对色素上皮衍生因子的降解抑制高氧诱导的小鼠视网膜新生血管的形成。

　　1材料和方法

　　1.1材料 实验动物选取7d龄SPF级C57BL/6J新生小鼠48只，体质量3.5～4g, 经检查无眼疾,由新疆医科大学实验动物中心提供，雌雄不限，与母鼠一起饲养至适当日龄。实验分为正常组、高氧组、对照组及治疗组，每组12只。正常组:在正常空气环境下饲养10d,不做任何处理;高氧组:在高氧环境下饲养5d后在正常氧环境饲养5d,不注射药物;GM6001干预组:在高氧环境下饲养5d,行玻璃体腔内注射GM6001,后置于正常氧环境中饲养5d;对照组:在高氧环境下饲养5d,行玻璃体腔内注射磷酸盐缓冲液 (PBS),后置于正常氧环境下饲养5d。在出生后17d时，右眼剥离视网膜迅速置于液氮中，左眼摘除眼球做免疫组化。 所用设备：氧舱(自制)为40cm×30cm×20cm 玻璃制作的密闭容器，设有 2个圆形孔，一孔接 100%医用湿润氧气，控制阀可控制氧气流量，另一孔接氧气分析仪; Olympus OME手术显微镜(日本);TOPCON PS11E裂隙灯显微镜(日本);眼科显微手术器械(苏州六六视觉有限公司);氧分压仪CYS1型：(上海市嘉定学联仪表厂);LEICA RM 2135型切片机(德国); 31G注射器 (自制)用橡胶线圈将最大刻度为5μL的注射器最小刻度为0.1μL的微量注射器和诺和灵R 31G针头连在一起。主要试剂：一抗羊抗人PEDF 多克隆抗体(Santer Cruze 公司，美国);二抗生物素化兔抗羊多克隆抗体，免疫组织化学试剂盒( 北京博奥森生物技术有限公司);一抗鼠抗人CD34单克隆抗体(福州迈新生物技术有限公司);二抗生物素化兔抗鼠多克隆抗体，免疫组织化学试剂盒( 北京博奥森生物技术有限公司);GM6001 (CHEMICON International，Inc.USA);ELISA试剂盒购买于上海麦莎公司。

　　1.2方法

　　1.2.1 ROP小鼠模型制备 将7d龄新生小鼠连同哺乳母鼠一同置入密闭氧箱吸入高氧(75±5)% 5d，再返回正常空气中饲养，制备新生小鼠视网膜病变模型。氧箱氧气浓度控制在(75±5)% ，温度控制在(23±2)℃ ，每天更换垫料，添加饲料、水，母鼠每天拿出氧箱6h。

　　1.2.2实验步骤 治疗组小鼠腹腔注射氯胺酮(50mg/kg)麻醉，用美多丽散瞳，点表麻药，在立体显微镜下使微注射器针头透过结膜在鼻上或颞上象限距角膜缘处以40°～60°朝向赤道区刺入玻璃体腔，将注射器内的GM6001注入1μL(100μmol/L)，并停留约1min后拔针。ELISA 动物麻醉后，摘除眼球，将眼球置于冰块上，在冷光显微镜下迅速剥离视网膜，迅速置于液氮中，然后放在80℃冰箱中保存备用。组织提取蛋白后，在酶标板上依照次序对应加入50μL的标准品于空白微孔中;分别标记样品编号，加入50μL样品于空白微孔中;在样品孔中加入10μL的生物素标记液;在标准品孔和样品孔中加入50μL的酶标记溶液;(36±2)℃孵育反应60min;洗板机清洗5次，每次静置10～20s;每孔加入底物A、B液各50μL;(36±2)℃孵育反应15min;每孔加入50μL终止液，终止反应;在波长450nm的酶标仪上读取各孔OD值;以OD值的对数值为纵坐标，以标准品对数值为横坐标绘制双对数曲线，并求出公式，根据求得的OD值的对数值求出相应的样品浓度。

　　1.2.3 PEDF免疫组织化学检测 石蜡切片常规切片至水，EDTATRIS缓冲液(pH值9.0)，高压抗原修复10min[1]，30mL/L过氧化氢室温抚育10min,PBS溶液浸洗后加入200g/L兔血清封闭10min，滴加PEDF(工作浓度为1∶50)一抗工作液4℃过夜，滴加生物素标记兔抗羊IgG二抗37℃ 30min,链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物(streptavidinbiotin peroxidase complex,SABC)37℃ 30min，DAB显色，苏木素复染后封片。

　　1.2.4 CD34免疫组织化学检测 按试剂盒说明进行石蜡切片常规切片至水，EDTATRIS缓冲液(pH值9.0)，高压抗原修复10min，30mL/L过氧化氢室温抚育10min,PBS溶液浸洗后加入200g/L兔血清封闭10min，滴加CD34(工作浓度为1∶400)一抗工作液4℃过夜，滴加生物素标记兔抗羊IgG二抗37℃ 30min,链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物(streptavidinbiotin peroxidase complex,SABC)37℃ 30min，DAB显色，苏木素复染后封片。

　　统计学处理：使用SPSS 13.0 for windows软件对所有数据进行统计学分析。各组间均数比较，组间两两比较均采用方差分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2结果

　　视网膜组织切片HE染色 正常组未见明显的突破内界膜的血管内皮细胞细胞核;高氧组和对照组则显著增多,有的形成新生血管芽,有的形成新生血管团;GM6001干预组突破内界膜的血管内皮细胞细胞核明显减少。

　　2.1免疫组织化学检测结果 PEDF阳性表达产物成棕黄色，小鼠视网膜各层可见阳性表达，其中以神经节细胞层及神经纤维层表达为著，正常组小鼠为高表达，高氧17d龄时表达显著减少，只在神经节细胞层、神经纤维层有较高表达，其余各层表达极少。对照组与高氧组相似。GM6001组，在17d龄时仍为高表达，显著高于高氧组和对照组。CD34阳性表达产物成棕黄色,正常组未见明显的突破内界膜的血管内皮细胞，高氧组和对照组见大量突破内界膜的血管内皮细胞;GM6001干预组见少量突破内界膜的血管内皮细胞。生后第17d正常组、高氧组、GM6001干预组及磷酸盐缓冲液对照组平均每只眼球突破内界膜的血管内皮细胞细胞数分别为(0.33±0.19)个、(36.00±5.62)个、(4.58±0.47)个、(36.50±4.15)个,组间比较,差异有统计学意义(F=355.03,P<0.05),其中高氧组与正常组、GM6001干预组相比,差异有统计学意义(P<0.01);GM6001干预组与磷酸盐缓冲液对照组相比,差异亦有统计学意义(P<0.01); GM6001干预组与正常组相比,差异亦有统计学意义(P<0.01);磷酸盐缓冲液对照组与高氧组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。

　　1.2.2 ELISA检测结果 MMP2，MMP9，PEDF的含量GM6001组和PBS对照组及高氧组之间在统计学上均有差异P<0.01

　　GM6001组和正常组之间没有统计学差异P>0.05，高氧组和PBS对照组没有统计学差异P>0.05。

　　3讨论

　　多种眼部疾病与新生血管的形成有重要关系，例如早产儿视网膜病变(ROP)，老年性黄斑病变，增生性玻璃体视网膜病变，新生血管性青光眼等，由于手术过程中对眼部组织不可避免的损伤而使多种眼病的疗效欠佳，寻求一种有效的治疗新生血管的非手术疗法成为了当前研究的热点。为研究视网膜新生血管的治疗，我们选择了目前应用最广的模型是氧致小鼠视网膜新生血管动物模型。小鼠模型新生血管发生率为100%且可重复性好。以往的研究表明同一母鼠连续5d置于750mL/L氧浓度环境中，在第4～5d时母鼠容易因氧中毒导致肺病变而死亡。为此本实验在SPF级实验室中进行，对氧箱进行密封，在使氧箱浓度达到750mL/L后将氧流量调至最低，并从通氧第2d开始每天使母鼠在正常氧环境中生活6h左右，并在氧仓内应用干燥剂碱石灰，这样母鼠从未死亡，实验周期大大缩短。

　　多种因子参与了眼部新生血管的形成。其中色素上皮衍生因子是一种抑制新生血管形成的关键因子，色素上皮衍生因子由RPE细胞分泌[2]进入感光细胞间质，被认为是玻璃体和角膜中没有血管的主要原因[3]。在早产儿视网膜病变(ROP)的动物模型中，玻璃体腔内注射PEDF可以抑制视网膜新生血管的形成[4]。在ROP模型中，小鼠视网膜各层PEDF的表达在高氧环境中是逐渐升高的，离开高氧环境进入正常氧环境中时PEDF的表达逐渐降低[5]。随着PEDF的降低在第17d时有大量突破视网膜内界膜的新生血管形成。低氧被认为是PEDF降低的主要原因。Notari等[6]发现在低氧环境中(基质金属蛋白酶2)MMP2和MMP9(基质金属蛋白酶9)能够降解PEDF。基质金属蛋白酶可以降解细胞外基质的多种成分其中包括PEDF但不包括VEGF(血管内皮生长因子)。MMP2和MMP9是小鼠玻璃体腔内存在的两种主要的MMPS。我们通过实验证实在高氧组和PBS对照组中MMP2和MMP9的表达明显高于正常组和GM6001组。GM6001组和对照组相比PEDF的含量明显升高，而新生血管的数量明显降低。从而证实了在ROP模型中视网膜组织中PEDF的降低和MMP9及MMP2的表达升高有关。在以往的研究中发现玻璃体腔内注射小剂量的PEDF对新生血管的形成没有明显的抑制作用而大剂量的PEDF对新生血管的形成有明显的抑制作用[7]，我们的研究认为小剂量的PEDF对新生血管没有明显的抑制作用的原因可能是因为MMP2和MMP9对PEDF的降解。这提示在临床上MMPS抑制剂和PEDF的联合应用会取得更好的疗效。

　　我们曾在实验中通过免疫组化发现高氧组和对照组小鼠在第12d刚从高氧环境中取出时玻璃体腔内血管不明显，然而在第17d时发现玻璃体腔内有大量的新生血管的形成，这部分血管大部分在视网膜的周边部，其中部分血管应是视网膜血管在脱水过程中脱离到玻璃体腔内的,但我们未计数这部分新生血管内皮细胞。

　　GM6001是一种新型的广谱的MMPS抑制剂，是已知作用最强的人工合成的MMPS抑制剂，对MMP2和MMP9均有强大的抑制作用。基质金属蛋白酶促进视网膜新生血管的形成主要体现在以下3个方面：(1)降解细胞外基质有利于新生血管的出芽;(2)与VEGF协同作用促进VEGF的表达[8];(3)可以降解PEDF。所以抑制了MMPS的表达就从以上3个方面抑制了新生血管的形成。新的研究认为MMP2对PEDF的降解是PH值依赖性的，在PH值是7.4时只是把PEDF降解为46kDa没有活性的PEDF[9],我们实验所用的抗体均是针对50kDa的PEDF，没有对46kDa的PEDF做进一步的研究。目前MMPS抑制剂已经成为了一种抑制新生血管形成的有效的药物，成为了治疗老年性黄斑病变的一种新疗法[10,11]，并且在应用了MMPS抑制剂后PEDF的表达升高。

　　总之，玻璃体腔内注射GM6001后和对照组相比MMP2,MMP9的表达降低，而PEDF的表达升高。PEDF和MMPS在新生血管形成中均发挥重要作用，二者之间的相互作用具有至关重要的作用。因为MMPS对PEDF的降解，所以在临床上，PEDF和MMPS 的联合应用具有重要的意义。

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