甲硝唑滴眼液与角膜接触镜多功能护理液体外对棘阿米巴原虫的杀伤效果

　　作者：车成业　　作者单位：青岛大学医学院附属医院眼科,山东 青岛

　 【摘要】 目的 了解6种角膜接触镜多功能护理液和加入甲硝唑滴眼液的护理液对自生生活性棘阿米巴原虫的杀伤效果。方法 将6种多功能护理液分别加入96孔培养板中，每种护理液占用48孔，其中24孔滴入棘阿米巴悬液，另外24孔先滴入甲硝唑滴眼液后再滴入棘阿米巴悬液，室温静置8 h后在倒置显微镜下观察棘阿米巴的形态变化和数量。将残存的棘阿米巴原虫分别在PYG培养液中培养5 d，观察其形态、活性与增殖能力的变化。结果 单纯护理液组1～6号棘阿米巴原虫检出率分别为0、8.3%、29.1%、41.7%、62.5%、79.2%，加入甲硝唑滴眼液后护理液1～6号棘阿米巴原虫检出率分别为0、0、4.2%、8.3%、16.7%、16.7%，3～6号护理液加与不加甲硝唑滴眼液杀伤棘阿米巴原虫的效果差异有统计学意义(χ2=3.75～18.78，P<0.05)。残存的棘阿米巴原虫经培养后活力与增殖力减弱。结论 部分多功能护理液对棘阿米巴原虫的杀伤效果不佳，添加甲硝唑滴眼液后杀伤效果明显提高。

　　【关键词】 棘阿米巴属 角膜接触镜多功能护理液 甲硝唑

　　THE KILLING EFFICIENCY OF ARILIN AND CONTACT LENS SOLUTIONS ON ACANTHAMOEBA　　CHE CHENGYE, ZHAO GUIQIU, ZHANG JING, et al　　The Department of Ophthalmology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China

　　[ABSTRACT] Objective To analyze the killing efficiency of six kinds of contact lens solutions and solutions with arilin on freeliving Acanthamoeba. Methods The solutions were added into 96well microtiter plates respectively. Each care solution used 48 holes,24 of those holes were added with suspension of Acanthamoeba. The other 24 holes were added in arilin and suspension of Acanthamoeba. After standing in room temperature for eight hours, the morphologic changes and quantity of the remnant Acanthamoeba were observed under an inverted microscope. The remnant Acanthamoeba were cultivanted in PYGculture medium for five days. Then, their variation of appearance, activity and reproductive activity were observed. Results In the six experimental groups using contact lens solutions only, the detection rates of Acanthamoeba of were 0,8.3%, 29.1%,41.7%,62.5% and 79.2%, respectively. After arilin was added, the detection rates of Acanthamoeba of those six groups were 0,0,4.2%,8.3%,16.7% and 16.7%, respectively. From group 3 to group 6, after added in arilin, the differences of the killing efficiency of contact lens solutions were signficant (χ2=3.75-18.78，P<0.05). Cultivation of the remnant Acanthamoeba showed a reduction in their activity and proliferative ability. Conclusion The killing efficiency of some contact lens solutions on freeliving Acanthamoeba is not satisfied. Arilin can improve the killing efficiency of contact lens solutions.

　　[KEY WORDS] Acanthamoeba castellanii; Contact lens slutions; Arilin

　　棘阿米巴角膜炎由棘阿米巴原虫感染引起，是一种严重威胁视力的角膜炎。国外研究已证实，配戴被原虫污染的角膜接触镜及角膜轻度擦伤是诱发棘阿米巴角膜炎的主要原因[1]。合格的角膜接触镜多功能护理液应具备清洁、消毒和去蛋白三大功能[2]，所以理应在棘阿米巴角膜炎的预防中起到极为重要的作用。本实验选用市售的6种多功能护理液与自生生活性棘阿米巴原虫共同培养，以检验其杀伤效果，并与添加甲硝唑滴眼液的护理液的杀伤效果进行比较。

　　1 材料与方法

　　1.1 棘阿米巴原虫的培养

　　标准棘阿米巴菌种(CW1)购于北京市眼科研究所。实验前在28 ℃温箱，含有青霉素(500 kU/L) 和链霉素(500 kU/L)的蛋白胨酵母葡萄糖(PYG)培养液中无菌纯培养3～5 d至对数生长期。倒置显微镜下观察可见：PYG培养液中，阿米巴原虫有滋养体(80%以上)和包囊两种形态。滋养体多为不规则长圆形,体表有多个细小的棘刺状突起,胞质内可见多个空泡;包囊类圆形,有两层囊壁,内壁呈多面体形。血细胞计数板计数滋养体，制成滋养体浓度为3×107/L的悬液，振荡混匀。

　　1.2 多功能护理液

　　选择市售的6种角膜接触镜多功能护理液，均不包含甲硝唑及其有效成分。分别编号为1、2、3、4、5、6号。生产日期均为2007年4～8月，保质期2年。实验日期均在保质期内。

　　1.3 实验方法

　　使用3张无菌96孔板，每种护理液占用48孔，使用微量加样器在每个孔中加入护理液100 μL，再于其中的24孔中加入2 g/L甲硝唑滴眼液100 μL，所有孔中加入浓度为3×107/L的阿米巴原虫悬液1 μL。倒置显微镜观察，全部孔中均可见棘阿米巴原虫。室温静置8 h后在倒置显微镜下观察阿米巴原虫的形态变化和数量。

　　1.4 残存阿米巴原虫的培养

　　将3张96孔板中剩余的1～6号护理液收集后离心去上清(2 000 r/min，离心5 min)，再加入PYG培养液2 mL进行培养。同时设置对照组，取浓度为3×107/L的阿米巴悬液24 μL，同样方法离心去上清，加入2 mL的PYG培养液培养。5 d后观察并比较两组残存阿米巴原虫的形态、活性与增殖能力的变化。

　　2 结 果

　　2.1 培养8 h后阿米巴原虫的检出率

　　室温静置8 h后在倒置显微镜下观察可见，无阿米巴原虫存活的液体中散在细胞碎片，无完整滋养体或包囊;有阿米巴原虫存活的液体中阿米巴原虫数量减少，几乎均呈包囊状态，有少量细胞碎片。实验表明，市售的6种多功能护理液中, 除第1、2号护理液可以有效的杀死棘阿米巴原虫外，其余对棘阿米巴原虫的杀伤能力较差。统计学分析示，第1、2号护理液加与不加甲硝唑，阿米巴原虫检出率的差异无统计学意义，其余护理液加与不加甲硝唑阿米巴原虫检出率的差异均具有统计学意义(χ2=3.75～18.78，P<0.05)。见表1。表1 6种不同护理液加与不加甲硝唑对阿米巴原虫检出率的影响(略)

　　2.2 培养5 d后阿米巴原虫的检出率

　　倒置显微镜下观察可见：对照组阿米巴原虫生长旺盛，滋养体数目不少于全部原虫数的80%。不加甲硝唑的1、2号护理液培养后未见存活阿米巴原虫，3～6号护理液棘阿米巴原虫数量无明显增多，且大多为包囊状态，偶见滋养体。加甲硝唑的1～3号护理液培养后未见存活阿米巴原虫，4～6号护理液原虫数量也无明显增多，散见包囊。

　　3 讨 论

　　棘阿米巴角膜炎是一种严重的致盲性角膜疾患，目前国内对其尚无特效的药物，常须行角膜板层切除甚至穿透性角膜移植来治疗[3]。近年来，随着我国角膜接触镜配戴人数的增多，本病的报道呈快速上升趋势。除了在诊断和治疗方面应积极对其进行相应的研究外，增强预防手段也可以在很大程度上减弱其对人类角膜健康的威胁。

　　棘阿米巴角膜炎的发生与一定的危险因素有关,主要包括:配戴角膜接触镜、污染的水源和角膜外伤等[4]。在发达国家,71%～85%的病人发病与配戴角膜接触镜有关,并且研究发现各种角膜接触镜均可成为棘阿米巴原虫潜在的携带体。在我国的棘阿米巴性角膜炎中有33%左右与角膜接触镜配戴有关[5]。造成接触镜源性棘阿米巴角膜炎的主要原因包括：配戴者的不良卫生习惯造成的接触镜及护理液等用品的污染，长期配戴导致角膜抵抗能力下降，未能及时清理接触镜上附着的蛋白而利于棘阿米巴原虫的黏附等[6]。所以，角膜接触镜护理液的消毒和清洁功能是确保健康配戴的基础，是针对棘阿米巴角膜炎的一项重要预防措施。

　　本实验选取了市场上销售量较大的6种角膜接触镜多功能护理液，按照角膜接触镜日戴夜护理的常规，设计了8 h 的观察时间，以检验护理液在其有效护理时间内对棘阿米巴原虫的杀伤能力。同时，设置加入甲硝唑滴眼液辅助的护理液组，以观察等量配制的 2 g/L甲硝唑滴眼液与护理液混合后对棘阿米巴原虫的杀伤能力。结果显示，单纯6种护理液 8 h 平均杀灭棘阿米巴原虫率为 63.2%。后续的培养结果显示，阿米巴原虫经过护理液8 h 处理，即使不能被完全杀灭，也大多成为活力较低的包囊状态，增殖能力至少在一个培养周期内大幅度降低甚至消失。

　　临床上甲硝唑为肠道阿米巴病的一线药物，也可用于棘阿米巴角膜炎的治疗[7]。目前认为棘阿米巴原虫缺乏线粒体而不能产生足够量的ATP，但其虫体膜上有一种名为Hydrogen soma的细胞器，能将丙酮酸转化为乙酰辅酶A，但由于此结构不能还原嘧啶核苷酸，却能将丙酮酸上的电子转移到甲硝唑这类药物的硝基上，形成有毒还原产物[8]，后者又与DNA和蛋白质结合，从而产生对阿米巴原虫的选择性毒性作用[9]。本实验制作的甲硝唑滴眼液与护理液混合液 8 h 平均杀灭棘阿米巴原虫率可达到 92.4%，有更好的预防棘阿米巴角膜炎作用。

　　角膜接触镜护理液在对抗感染性角膜炎中的屏障作用已经越来越被重视，研制和开发护理液的机构应进一步提高护理液的质量，更好地为角膜接触镜配戴者的角膜健康服务。

　　【参考文献】

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