不同剂量瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导的人单核-巨噬细胞组织因子表达的影响及机制
发表时间：2014-09-15 浏览次数：1030次
冠状动脉粥样硬化斑块破裂和继发血栓形成是急胜冠脉综合征(acutecoronarysyndrome,ACS)发病机制的关键.组织因子(TissueFactor,TF)依赖的凝血级联反应激活导致斑块破裂和血小板豁附继发血栓形成影响冠心病的发生和发展‘体外实验证实,氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)能使大多数的巨噬细胞发生凋亡并表达TFZ瑞舒伐他汀(rosuvastatin)通过竞争性抑制HMG-COA还原酶产生降低LDL,干扰脂蛋白生成,降低血清ox-LDL含量,且有研究显示,它可呈量效关系降低ACS患者血清中的LOX-1水平.笔者旨在观察瑞舒伐他汀能否呈剂量依赖性减少ox-LDL诱导的单核巨噬细胞TF的表达,并进一步探讨其机制. 1资料与方法 1.1一般资料2011年6月山西医科大学第二临床医院体检中心采取健康成人静脉血60ml;RPMI-1640培养液、胎牛血清购自杭州四季青公司;人淋巴细胞分离液由上海华精生物高科技有限公司出售;佛波醋、多聚肌普酸均购自美国SIGMA公司;购自天根生化科技有限公司的TRIzoI;FITC-CD14抗体购自日本BeckmanCoulte:公司;超纯RNA提取试剂盒、1-iiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒、LI-traSYBRMixture(withRox),Dnasel均购自北京康为世纪生物科技有限公司;引物序列购自上海生工生物有限公司;ox-LDL购自北京协生生物科技有限公司;瑞舒伐他汀由阿斯利康公司馈赠. 1.2研究方法 1.2.1人单核细胞的分离取健康人新鲜静脉血30ml,普通肝素抗凝后分至10个试管中.经离心洗涤等后,加含10%胎牛血清的RPMI-16405ml于各试管中,将单核细胞吹开混匀,于各培养瓶中分别加人细胞悬液,置于370C,5%的COz培养箱中孵育,培养4代后,取指数生长期细胞进行诱导转化实验. 1.2.2人单核细胞来源的巨噬细胞的诱导转化、培养与鉴定将160nmo>/ml的佛波脂、含胎牛血清的RP}'II-1640培养液加至单核细胞培养基中培养24h后,单核细胞转变成巨噬细胞,且巨噬细胞山悬浮生长变为贴壁生长,伸出伪足二使用台盼蓝染色测细胞存活率>95}/}特异荧光素标记的CD14细胞表面抗体行流式细胞仪鉴定巨噬细胞. 1.2.3试验分组试验分7组空白对照组:单独培养单核一巨噬细胞48h;ox-LDL对照组:单核一巨噬细胞培养基中加人.x-LDL50N 剔ml孵育48h;多聚肌昔酸(LOX-1受体阻断剂)组:250剔ml多聚肌昔酸预处理2h,再加人.x-LDL50}.,g/ml,}}育48h;不同剂量瑞舒伐他汀组:四组分别加人50},舒mlox-LDL孵育2h后,再加人瑞舒伐他汀各0.01,0.1,1,5}.,mol/L培养48h01.2.4用RealTimePCR检测各组中LOX-1mRNA和TFmRNA表达的水平(1)RNA提取:取TRIzol1.0ml分别加至每孔,经沉淀、洗涤后,溶解于去核糖核酸酶水(RNase-free}ater)30闪中,应用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA(取5浏RNA)0(2)反转录反应:采用HiFi-IVIMLVcDNA第一链合成试剂盒月-在20闪体系中进行:含引物2闪,RNA模板2闪、逆转录混合反应体系混合物,5x4浏,HiFi-MMLV酶复合物1闪、去核糖核酸酶水11闪,于PCR仪42℃反应1h,70℃灭活l0min,最后得到〔'DNA在-20℃保存.(3)PCR扩增反应:TF上游引物序列为:5=CCGACG-AGATTGTGAAGGr'TGTG-3;下游序列为:5=TTGTTGGCTGTCCGAGGTTTGT-3^LOX-1上游引物序列为:5=ACCACCAGAATCTGA:4TCTCCAA-3';下游引物序列为:5-CCAGTT_4AATGAGCCCGAG-GAA-3'}PCR反应条件:95℃预变性10min,95℃变性15s,600C退火60s,72℃再延伸60:,然后循环40次.(3-actin上游引物序列为:5-CCTGAG-GCACTCTTCCAG-3;下游引物序列为:5-TC.ACACT-TCATGATGGA-3,产物大小为100by0(4)荧光定量PCR结果分析:通过完成实时荧光定量PCR反应得到Ct值.mRNA表达相对量用2-aact表示,其中}OCt=(Ct靶基因一Ct内参)处理组一(Ct靶基因-Ct内参)未处溯.把空白对照组设为未处理组. 1.2.5IJLISA法测TF蛋白含量的表达用LLISA法测定六孔培养板的上清液,操作严格按试剂盒说明书进行. 1.3统计学处理本实验中各组结果均以x1s表示,SPSS13.0建立数据库,应用单因素方差分析,组间两两比较时采用LSD-t检验.P<0.O5为差异有统计学意义. 2结果 2.1PCR产物的确定分析LOX-1基因、TF基因、内参(3-actin基因RT-PCR产物的融解曲线峰值分别为79.0℃,82.50C,77.5℃.三者融解曲线平滑无切迹,锋线较锐利,证实其RT-1'CR产物无异常扩增,特异性较强. 2.2对.x-LDL诱导人单核一巨噬细胞LOX-1mR-NA的表达影响7组间比较差异有统计学意义(F=91.334,P<0.OS).ox-LDL组、多聚肌昔酸组及各剂量瑞舒伐他汀组与空白组比较,LOX-1mRNA的表达均明显增加(均P<0.05);多聚肌普酸组与ox-LDL组比较,LOX-1mRNA表达下降(P=0.018);不同剂量(0.O1}.,mol/L,0.1}A,mol/I,,1}..},mol/L,5N mol/L)瑞舒伐他汀组与〔>x-LDL组比较,LOX-1mRNA表达下降(P=0.013,P=0.005,P<0.05,P<0.01),呈剂量依赖性,差异有统计学意义;不同剂量瑞舒伐他汀组间两两比较(各组间尸均<0.O5),各组间差异有统计学意义,即随着瑞舒伐他汀剂量增加,LOX-1mRNA表达逐渐减少.见表1. 2.3对.x-LDL诱导人单核一巨噬细胞I'FmRNA的表达影响7组间比较差异有统计学意义(F=58.833,P<0.05).ox-LDL组、多聚肌普酸组及各剂量瑞舒伐他汀组与空白组比较,TFmRNA的表达均显著增加(均P<0.05);多聚肌苦酸组与ox-LDL组比较,TFmRNA表达下降(P<0.05);不同剂量瑞舒伐他汀组与ox-LDT组比较,TFmRNA表达下降(均P<0.05),呈剂量依赖性,差异有统计学意义;不同剂量瑞舒伐他汀组间两两比较(各组间均P<0.05),各组间差异有统计学意义,即随着瑞舒伐他汀剂量增加,TFmRl}'A的表达逐渐减少.见表1} 2.4对.x-LDL诱导人单核一巨噬细胞TF的表达影响7组间比较差异有统计学意义(F=103.552,P<0.05)}ox-LDL组、多聚肌昔酸组及各剂量瑞舒伐他汀组与空白组比较,TF的表达均明显增加,差异有统计学意义(均P<0.05卜多聚肌普酸组与ox-LDL组比较,TF的表达下降(P<0.05);不同剂量瑞舒伐他汀组与ox-LDL组比较,TF的表达下降(P<0.05,P=0.007,P<0.05,P<0.05),呈剂量依赖性,差异有统计学意义;不同剂量瑞舒伐他汀组之间进行两两比较,各组间差异有统计学意义(均P<0.05),即随着瑞舒伐他汀剂量逐渐增加,TF的表达逐渐减少.见表1. 3讨论 TF是激活外源性凝血系统的关键因子.生理情况下,直接与血液接触的血细胞和内皮细胞不表达TF,只有血管壁损伤和受刺激后才释放〔a-.在动脉粥样硬化(at}erosclerosis,AS)斑块中泡沫细胞、单核细胞都表达TF,它以自分泌或旁分泌的方式促平滑肌细胞迁移,促AS形成,在粥样硬化及血管栓塞再通后狭窄,尤其斑块破裂血栓形成等病理过程中有重要作用5.ox-LDL增加内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞TF的表达[6〕.ox-LDL有较强的细胞毒性,可直接损伤内皮细胞进人内膜;增强单核细胞对内皮细胞的粘附,促单核细胞向巨噬细胞转变〔7伙吞噬大量.x-LDL后形成泡沫细胞沉积在血管壁,使血管内皮崩解、形成溃疡,血小板、纤维蛋白继发沉积附着加速血栓形成,是AS形成的重要病理因素〔8}}LOX-1是.x-LDL的受体,可以结合、内吞、降解ox-LDL,促进泡沫细胞形成,增强其摄取ox-LDL的功能9;;在AS中,二者结合可致粥样斑块的纤维帽变薄、脂核增大、炎症反应等,进而使斑块不稳定、破裂、血栓形成,最终导致ACS发生.故探索与ox-LDL竟争结合LOX-1的药物,阻断LOX-1的生物学作用,降低TF的表达,对早期预防AS及ACS至关重要.瑞舒伐他汀是新一代HMG-COA还原酶抑制剂,能显著降低低密度脂蛋白、甘油三脂及升高高密度脂蛋白;抗动脉粥样硬化、逆转斑块;抑制胆固醇醋在巨噬细胞的堆积,抑制平滑肌细胞的增殖、迁移,抑制血栓形成.但能否通过抑制ox-LDL途径减少单核一巨噬细胞TF的表达尚未阐明. 本研究用人单核一巨噬细胞与ox-LDL共同孵育后,发现细胞LOX-1mRNA,TFmRNA的表达明显上调,提示ox-LDL可诱导单核一巨噬细胞LOX-1受体蛋白、TF蛋白表达增加.多聚肌营酸预处理2h后,再加人.x-LDL与细胞共同培养48h后,LOX-1mRNA,TFmRNA表达下调,表明LOX-1可介导ox-LDL使单核一巨噬细胞LOX-1mRNA,TFmRNA表达增多,即LOX-1介导的ox-LDL途径促使TF表达.将不同剂量瑞舒伐他汀与.x-LDL诱导的单核一巨噬细胞共同培养后,LOX-1mRNA,TFmRNA表达下调,且呈剂量依赖性,同时,TF的表达随此药浓度的增加而减少,从而减抵AS斑块中血栓发生率,降低急性冠脉事件发生,但是否为人单核一巨噬细胞TF减少的唯一途径有待进一步探索. 参考文献 [1].刘乐,雷长城. 组织因子及其抑制物与急性冠脉综合征研究进展[J].社区医学杂志,2008,(23):31-32.doi:10.3969/j.issn.1672-4208.2008.23.018. [2].朱颖,罗心平,马端. 组织因子和组织因子途径抑制物与动脉粥样斑块形成关系的研究进展[J].心血管病学进展,2007,(05):756-762.doi:10.3969/j.issn.1004-3934.2007.05.030. [3].严庆场,吴广华. 瑞舒伐他汀对急性冠脉综合征患者CRP、LOX-1的影响[J].中国全科医学,2011,(04):581-632. [4].黎娜,朱文玲,柯元南. 冠心病的治疗与组织因子[J].中日友好医院学报,2007,(01):47-49.doi:10.3969/j.issn.1001-0025.2007.01.015. [5].童国新,王宁夫,陈鹏. 阿托伐他汀对oxLDL诱导的人单核-巨噬细胞MMP-9和组织因子的影响[J].基础医学与临床,2007,(02):178-182.doi:10.3969/j.issn.1001-6325.2007.02.013. [6].Mackman N,Tilley RE,Key NS. Role of the extrinsic pathway of blood coagulation in hemostasis and thrombosis[J].Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology,2007,(08):1687-1689. [7].Pasini AF,Anselmi M,Garbin U. Enhanced levels of oxidized low-density lipoprotein prime monocytes to cytokine overproduction via upregulation of CD14 and toll-like receptor 4 in unstable angina[J].Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology,2007,(09):1991-1997.
