抗衰老Klotho基因的功能及与人类疾病的关系

　　作者：袁丹,陈海平　　作者单位：首都医科大学附属北京友谊医院医疗保健中心老年肾病科，北京

　　【关键词】 Klotho基因;基因表达;基因变异;衰老性疾病

　　抗衰老基因Klotho(KL)是1997年研究自发型高血压时发现的与衰老有关的基因〔1〕。该基因突变小鼠会过早出现与人类衰老相似的多种表现，并使其寿命缩短，而通过转基因使KL过度表达会减轻小鼠的衰老症状，延长寿命。研究显示KL基因缺陷鼠的寿命仅为野生鼠的5%～6%〔2〕，而其过度表达会使小鼠的寿命延长(雌性和雄性分别延长20%和30%)〔3〕。但是，KL基因的基础研究与人类衰老性疾病关系的研究较少。

　　1 KL的生物学特征

　　人和小鼠的KL基因定位于染色体13q12区域，大鼠定位于12q12区域，在KL基因结构中，其mRNA存在一个可变剪切位点，因而KL能表达膜型和分泌型两种蛋白。免疫组化和PTPCR分析表明：KL基因高表达仅限于肾脏和脑脉络膜〔4〕，但KL蛋白可对其他组织和细胞发挥作用，提示KL蛋白具有激素样作用〔5〕。

　　2 KL蛋白的功能

　　2.1 调节体内钙磷水平

　　体内钙、磷平衡通过3个器官系统的共同作用而维持：消化道、肾脏和骨骼。KL基因缺陷小鼠在衰老同时，往往伴发高钙血症和高磷酸盐血症，提示KL与钙磷代谢有密切的联系。成纤维生长因子23(FGF23)是一种来源于骨骼的激素，作用于肾脏，抑制磷的重吸收和维生素D(VD)的生物合成，增加尿磷排泄和抑制血清1,25(OH)2D3的水平〔6〕。研究证明，肾脏表达的KL蛋白其胞外区可与多种FGF受体直接结合，在FGF23的信号传导过程中发挥协同受体的作用〔7〕。KLFGF23信号传导刺激增生并且阻止VD介导的凋亡〔8〕。因而，KL和FGF23可能以共同的信号通路调节体内的电解质平衡。KL缺陷大鼠会阻断KLFGF23的信号传导通路，导致体内1,25(OH)2D3产生增多〔1〕，血清1,25(OH)2D3高水平促进钙和磷在小肠的重吸收，导致高钙血和高磷血症〔2〕。1,25(OH)2D3增多可能是KL突变鼠产生衰老症状的主要原因。通过饮食控制磷和VD的摄入或剔除1a水解酶基因〔编码1,25(OH)2D3合成酶〕可以减轻几乎所有的衰老表型，延长寿命〔4〕。血液中钙水平升高易导致血管和软组织产生异位钙化，这可能是KL缺陷鼠和FGF23敲除鼠出现几乎相同的生理和生化表现的原因。另一方面，膜型KL蛋白可通过增加肾远曲小管上皮细胞膜瞬时受体电位离子通道5(TRPV5)的表达，提高钙在肾脏的重吸收。TRPV5是表达于远曲小管上皮细胞的上皮性钙通道(钙通过此通道进行跨细胞重吸收)，参与维持体内钙平衡〔9〕。KL蛋白的胞外区(KL 1和2)与糖苷酶家族1糖苷酶具有同源性，已证实KL蛋白具有微弱的葡糖苷酶活性，将重组KL蛋白加入人胚肾细胞(HEK293)细胞(一种表达TRPV5的人肾小管上皮细胞)的培养基中，会增加钙内流和细胞表面TRPV5的表达，说明KL蛋白葡糖苷酸酶活性对激活TRPV5离子通道起重要作用〔4〕。最近研究指出，人类细胞的KL蛋白胞外区通过水解TRPV5 N聚糖链的末端唾液酸而激活胞浆膜固有的TRPV5〔10〕。KL水解末端唾液酸使半乳素1结合于TRPV5，减少TRPV5的内化，增加TRPV5在胞膜表面的储留。KL与TRPV5和钙结合蛋白D28(VD敏感的细胞内钙转运蛋白)共表达于远曲小管细胞，形成肾单位的特殊区域，使该处的钙进行跨细胞重吸收〔11〕。KL与TRPV5和钙结合蛋白D28的这种共定位对体内的钙平衡起重要作用。

　　2.2 抵抗氧化应激

　　机体代谢产生的活性氧类物质(ROS)是造成细胞损伤的重要原因，该损伤被称为氧化应激。氧化应激可引起许多生物大分子如DNA、脂类和蛋白质等的损伤，使细胞功能衰退，最终机体表现出衰老特征〔12〕，转KL基因可通过减少超氧化物的生成阻止自发性高血压的进展、减轻造成的肾脏损伤〔13〕。研究表明，对胰岛素/胰岛素样生长因子1信号传导通路适度抑制是抵抗衰老的机制之一〔14〕。KL蛋白对胰岛素/胰岛素样生长因子1的调节包括哺乳动物在细胞和生物水平上对氧化应激的抵抗〔15〕。因为哺乳动物特异性转录因子(FOXO：FOXO1、FOXO3a和FOXO4)受到胰岛素/胰岛素样生长因子1信号传导的负性调节〔4〕，信号的活化使丝氨酸苏氨酸激酶磷酸化并将其激活，该酶活化后使FOXOs磷酸化。磷酸化的FOXOs从胞核内释放、失活，如果该过程被打断，核内FOXOs直接与抗氧化应激酶(包括过氧化氢酶和线粒体锰超氧化物歧化酶)的启动子结合，上调其表达，有利于活性氧类物质的移除，进而抵抗氧化应激〔16〕。研究发现〔17〕与野生型鼠相比，转KL基因鼠其肌肉中抗氧化应激酶表达增多，磷酸化的FOXOs减少，其尿液中8羟基脱氧鸟苷(DNA氧化损伤标志物)水平降低，提示KL可通过抑制胰岛素/IGF1信号转导，降低FOXOs磷酸化，激活FOXOs，增加抗氧化应激酶的表达，因而抵抗氧化应激。

　　2.3 保护血管内皮细胞

　　KL蛋白对血管内皮细胞有抗衰老和抗凋亡的作用，研究认为KL是一种体液因子，血管内皮细胞持续地与之接触。血管内皮对控制血管管径发挥重要作用：乙酰胆碱刺激内皮细胞释放NO，继而血管舒张，但KL缺陷鼠严重减弱主动脉及大动脉的乙酰胆碱刺激的内皮依赖性血管舒张作用〔18〕。KL缺陷鼠尿中NO降解产物(NO2和NO3)明显降低，因而KL可能上调NO的产生，应用NO合酶抑制剂Nw硝基左旋精氨酸酯使野生型和KL杂合子鼠的尿中NO2和NO3的排泄量降至相同水平，提示KL缺陷引发的NO生成减少导致内皮NO生成受抑制。通过转KL基因可使OLETF鼠的NO产生增加，该鼠表现多种疾病，如糖尿病、高血压、高脂血及肥胖〔2〕。有趣的是将野生型和KL杂合子鼠连体结合，逆转了KL缺陷鼠的内皮功能，提示KL蛋白可能作为体液因子维持正常的内皮功能。尽管KL杂合子鼠的血磷和VD水平正常，但是KL保护作用明显降低，因此，KL缺陷鼠的NO合成降低可能不是继发于高磷血症或高VD合成，其介导NO合成机制还不清楚，但是KL缺陷可能通过下调NO合酶进而减少NO的合成。另外，研究证实：KL蛋白可作为循环体液因子上调内皮细胞中第二信使cAMP的表达，重组KL蛋白能增加人脐静脉内皮细胞血管紧张素转换酶(ACE)Ⅰ的活性〔19〕，并且能上调cAMP在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的表达，并呈现时间和剂量依赖性，另外cAMP依赖性蛋白激酶A(cAMPPKA)的抑制剂 RpcAMP可完全抑制KL蛋白对ACE的作用，提示KL蛋白可通过cAMPPKA依赖性途径增加ACE在HUVECs的活性。进一步研究证实，重组KL蛋白通过cAMPPKA依赖性途径增加HUVECs上锰超氧化物歧化酶的活性和NO的产生，抵抗血管紧张素Ⅱ引发ROS生成造成的内皮损伤〔20〕。

　　2.4 抑制Wnt信号

　　Wnt是一种分泌型糖蛋白，通过自分泌或旁分泌作用与位于细胞膜上受体相结合，激活胞内各级信号传导分子，调节靶基因表达，在胚胎发育过程中对细胞的增殖、分化、极性、迁徙和凋亡均起到重要作用〔21〕。最近研究报道分泌型KL蛋白能与多种Wnt配体结合，抑制Wnt信号的激活〔22〕，尽管Wnt信号传导活性是干细胞增值及生存必需的，但其持久激活会导致干细胞快速衰竭〔23〕，因干细胞功能障碍阻碍组织修复，进而影响衰老进程，分泌型KL蛋白抑制Wnt信号的功能缺失可能是KL缺陷鼠出现衰老表型的原因。与野生鼠相比，KL缺陷鼠皮肤毛囊内的表皮干细胞数量减少，Wnt信号活性增强且内源性细胞衰老标志物呈高表达，提示KL缺陷导致Wnt信号持续活化，进而引起干细胞衰老。KL缺陷鼠出现的骨骼表型也可能部分是由Wnt信号变化引起的〔24〕，其骨皮质变薄，但胫骨干骺端骨小梁增加。与野生型相比，该处Wnt信号选择性增强，因Wnt信号可增强成骨细胞的增殖及成活，Wnt信号选择性增强可解释为何KL鼠干骺端骨质增加。

　　3 KL变异与人类疾病的关系

　　研究发现〔25〕，10岁之前人类血清中分泌型KL蛋白水平很低，30～40岁时达高峰，此后随着年龄增长逐渐降低。研究发现KL基因的单核苷酸多态性变异与人类衰老性疾病的产生具有相关性〔26〕。研究者发现了该基因的六个单核苷酸多态性变异，其中两个变异导致了氨基酸替换(F352V和C370S)。由于第352位的苯丙氨酸在真核细胞生物同源蛋白质中相当保守，所以该位点的突变可能改变KL蛋白的分泌及酶活性，该突变的杂合子型有助于长寿，而纯合子型则相反，因在长寿老人中纯合子型明显降低。国内学者研究发现〔26〕，KL基因编码区的F352V和C370S多态性，杂合子对患冠状动脉硬化性心脏病有保护作用，提示KL基因变异影响人类寿命。另外，纯合子变异与心血管病的危险因素(包括低水平的高密度脂蛋白胆固醇、高收缩期血压)及最新确立的中风、冠状动脉疾病早发的独立危险因素有关〔27〕，中国汉族人群中，启动子区G395A多态性中的AA基因型易患高血压，GG基因型可能对患冠状动脉硬化性心脏病、糖尿病有保护性作用〔26〕，G395A等位基因可能是动脉硬化的遗传学保护因素〔28〕，但最近也有研究发现〔29〕，G395A等位基因是韩国人群患冠状动脉疾病的独立危险因素，考虑KL基因单核苷酸多态性变异对不同种族作用不同。

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