糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡与视网膜组织中钙镁离子的关系

　　作者：严宇清，李凯军，何剑峰 作者单位：广西医科大学第一附属医院眼科，广西南宁530021

　　【摘要】 目的 观察糖尿病大鼠视网膜组织中细胞凋亡量的变化。方法 40只Wistar大鼠被随机分成实验组和对照组，每组20只。实验组用链脲佐菌素(Streptozocin, STZ)诱发糖尿病。并在糖尿病发病后4、6、12和16周检测视网膜细胞凋亡和视网膜组织中钙镁离子浓度的变化。同时对其与空腹血糖、糖化血红蛋白及糖尿病病程的关系进行了分析。结果 糖尿病大鼠视网膜细胞溶解液中在发病后4周可测到细胞凋亡，且随糖尿病病程的延长凋亡程度逐渐加重;同时伴有视网膜组织内钙离子浓度的增加、镁离子浓度减少。双变量相关分析表明，糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡的程度与空腹血糖浓度、糖化血红蛋白水平、视网膜内钙镁离子含量及糖尿病病程密切相关。结论 糖尿病大鼠视网膜中存在细胞凋亡和离子含量的异常，这些变化可能是糖尿病视网膜病变的病理基础之一。

　　【关键词】 糖尿病;视网膜;细胞凋亡;钙;镁;大鼠;动物实验

　　Retinal cells apoptosis and its relationship with concentration fluctuations of Ca2+ and Mg2+ in rats with diabetes mellitus

　　YAN Yu-qing, LI Kai-jun, HE Jian-feng

　　(Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning, Guangxi 530021, China)

　　Abstract: Objective To observe the changing of apoptosis quantity in retina of rats with diabetes mellitus (DM). Methods 40 Wistar rats were divided into two groups: experiment group (n=20) and control group (n=20). Rats with DM in the experiment group were induced by Streptozocin(STZ). The changes of Ca2+ and Mg2+ concentrations and the retinal cell apoptosis were measured by using absorption spectrophtometry at week 4, week 6, week 12 and week16 after the attack of DM. And the relation of apoptosis quantity with levels of fasting blood glucose (FBG), hemoglobin glycosylation (HbA1c), the concentration of Ca2+ and Mg2+ in retinal tissues, and the course of disease were also analyzed. Results The cells apoptosis could be detected in the retinal tissue solutions of diabetic rats four weeks after the attack of DM . With the development of DM, the cells apoptosis in retinal tissues worsen. Meanwhile, Ca2+ concentration elevated and Mg2+ concentration decreased. The changes of cells apoptosis were associated with the changes of FBG, HbA1c, the concentration of Ca2+ and Mg2+ in retinal tissues, and the course of disease. Conclusion There are cells apoptosis and abnormal ion concentration in the retinal tissues of rats with DM. These changes may be one of the pathologic basis of diabetic retinopathy.

　　Key words: diabetes mellitus; retina; calcium; magnesium; apoptosis; rats; animal experiment

　　糖尿病视网膜病变是糖尿病患者常见的慢性血管性并发症，也是发达国家中老年人常见的致盲性眼病[1,2]。其发病机理并不十分清楚，目前仍缺乏确切有效的治疗方法。为探讨糖尿病视网膜病变发生发展的有关因素，我们动态地观察了糖尿病大鼠视网膜组织中细胞凋亡与离子含量的变化。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物模型制作 选用成年纯系雄性20月龄Wistar大鼠(中山大学医学院动物中心提供)40只，体重320～350g，适应性喂养7天，禁食12h后按体重随机分成糖尿病组与正常对照组，每组20只大鼠。糖尿病组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin, STZ, Sigma公司，65mg/kg, 用0.1mol/L、pH 4.5柠檬酸盐缓冲液配制)诱发糖尿病，正常对照组大鼠腹腔注射等量柠檬酸盐缓冲液。动物单笼饲养，自由进食和饮水。40只大鼠于腹腔注射前及腹腔注射后第1天、第3天和第7天用微量血糖测定仪(One Touch II型血糖仪，堡灵曼公司)监测空腹血糖，以后每周测1次定性尿糖，每月测1次血糖。尿糖持续阳性，空腹血糖高于16.5mmol/L纳入糖尿病组。

　　1.2 标本处理 在糖尿病发病后第4、6、12和16周，麻醉下尾静脉采血测空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c);并迅速摘取眼球，取出视网膜组织，用精密天平称重后，以0.05mol/L冰冷磷酸缓冲液(pH7.8，含0.01mmol/L EDTA)，冰浴下制成10%的组织匀浆用作离子测定;1/2置于细胞培养液中，用眼科剪碎后，置于细胞裂解液中用作细胞凋亡检测。

　　1.3 ELISA法检测视网膜组织细胞凋亡 分别取4、6、12和16周大鼠的视网膜组织细胞溶解液进行分析，具体步骤按细胞凋亡检测试剂盒(采用Boehringer Mannheim公司试剂盒)说明进行。阳性对照由试剂盒提供，并设立空白对照(底物浓度)，最后在酶标仪上405nm/490nm波长下测定吸光值，计算细胞液中单、寡核小体的相对量，以富集系数(enrichment factor,EF)表示。计算公式为：

　　EF=样品的吸光值(mU)(诱导凋亡处理的细胞)对照品的吸光值(mU)(未经诱导凋亡处理的细胞)

　　1.4 视网膜组织内Ca2+、Mg2+含量测定 取视网膜组织匀浆20μl，用YarinAA-275series原子吸收分光光计测定，结果以每mg蛋白微摩尔数表示(μmol/mgpro)。

　　1.5 统计分析 全部数据经SPSS11.0统计软件处理，计量数据均以±s表示，组间比较用t检验，组内比较用单因素方差分析和H检验，各指标间的相关性用双变量相关分析。

　　2 结果

　　2.1 两组大鼠FBG变化比较 见表1。

　　表1 两组大鼠FBG变化情况比较(略)

　　2.2 两组大鼠HbA1c变化比较 见表2。

　　表2 两组大鼠HbA1c变化比较(略)

　　2.3 两组大鼠视网膜细胞凋亡量的变化 ELISA检测核小体(组蛋白伴随DNA片断)：结果显示，糖尿病大鼠视网膜细胞溶解液测得的吸光值(mU)有随糖尿病病程的延长而增高的趋势。与对照组比较，在各实验时点差异均有显著性(P均<0.01)，见表3。

　　表3 两组大鼠视网膜细胞溶解液吸光值的变化(略)

　　2.4 两组大鼠视网膜组织中Mg2+含量变化 见表4。

　　表4 两组大鼠视网膜组织中Mg2+含量变化(略)

　　2.5 两组大鼠视网膜组织中Ca2+含量变化 见表5。

　　表5 两组大鼠视网膜组织中Ca2+含量变化(略)

　　2.6 各指标间的相关分析 见表6。

　　表6 各指标间的相关分析(略)

　　3 讨论

　　凋亡(apoptosis)是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动性死亡过程。研究发现[3]：细胞凋亡失常(过度或不足)参与许多疾病的发生与发展。近年来越来越多的研究证实[4,5]，视网膜微血管细胞凋亡在糖尿病视网膜病变中起着十分重要的作用。凋亡的生化基础是核酸内切酶被激活，引起DNA断裂，形成180～200bp为最小单位的单体或寡聚体片断。本实验通过酶联免疫分析法(ELISA)检测细胞浆内组蛋白伴随DNA片断(单核小体和寡核小体)的多少而了解糖尿病大鼠发病后不同时期视网膜细胞凋亡的程度，这种检测方法可用于细胞凋亡的定量分析。研究表明[6]，出现细胞凋亡需要一段时间过程，但凋亡机制一旦启动，常很快发生。本实验结果显示：糖尿病大鼠视网膜细胞溶解液中在发病后4周可测到细胞凋亡，且随糖尿病病程的延长凋亡程度逐渐加重;同时伴有视网膜组织内Ca2+离子浓度的增加、Mg2+离子浓度减少，其与对照组大鼠比较差异均有高度显著性。双变量相关分析表明，糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡的程度与FBG浓度、HbA1c水平、视网膜内Ca2+离子含量及糖尿病病程高度正相关，而与视网膜内Mg2+离子含量高度负相关。说明糖尿病大鼠视网膜内细胞凋亡的发生及严重程度与机体内血糖和HbA1c水平的升高、视网膜组织内Ca2+离子含量增加、Mg2+离子含量降低及糖尿病病程的延长有关。

　　FBG和HbA1c是反映糖代谢控制好坏的客观指标，研究已证实[7]糖尿病病程的长短及糖代谢紊乱控制的好坏与糖尿病视网膜病变的发生发展密切相关。一些学者的研究也发现[8]，高糖环境可加速培养的牛眼视网膜周细胞凋亡，同时伴有细胞内Ca2+浓度的显著增加。本实验亦显示，在视网膜细胞凋亡的同时，视网膜组织中Ca2+浓度明显增加，Mg2+浓度则显著下降。Mg2+是激活和维持糖酵解过程中多个关键限速酶的主要辅助因子，糖尿病大鼠视网膜组织中Mg2+的异常下降必然影响视网膜组织的代谢机能，而导致或加速其视网膜病变的发生和发展。视网膜细胞内Ca2+含量的增加，可致细胞体积的变化和视网膜电生理的异常。视网膜组织中离子的异常可干扰视网膜组织的代谢，而糖尿病累及视网膜是先有视网膜组织代谢的改变，然后才有组织学或检眼镜下所见的血管异常[9]。

　　总之，糖尿病大鼠视网膜组织中存在细胞凋亡，同时伴有视网膜组织中Ca2+、Mg2+离子浓度的异常。这些改变可能是糖尿病视网膜病变的病理基础之一。

　　【参考文献】

　　[1] Kim J, Kim KS, Shinn JW, et al. The effect of antioxidants on glycated albumin-induced cytotoxicity in bovine retinal pericytes [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2002,292(4);1010-1016.

　　[2] Fong DS. Changing time for the management of diabetic retinopathy [J]. Surv Ophthalmol, 2002,47(Suppl 2):S238-S245.

　　[3] Carson DA, Ribero JM. Apoptosis and disease [J]. Lancet, 1993,341(8855):1251-1254.

　　[4] Mizutani M, Kern TS, Lorenzi M, et al. Accelerated death of retinal microvascular cells in human and experimental diabetic retinopathy [J]. J Clin Invest,1996,97(12):2883-2890.

　　[5] Naruse K, Sakakibara F, Nakamura J, et al. Enhancement and inhibition of mitogenic action of insulin-like growth factor I by high glucose in cultured bovine retinal pericytes [J]. Life Sci,1995,58(4)：267-276.

　　[6] 朱理安，关瑞锦，胡锡衷.柯萨奇B3病毒引起心肌细胞调亡的初步探索[J].中华微生物学和免疫学杂志，2000，20(3)：210-213.

　　[7] Masmiquel L, Segura RM, Mateo C, et al. Serum laminin as a marker of diabetic retinaopathy develoment: A 4-year follow-up study [J]. Am J Ophthalmol, 2000,129(3):347-352.

　　[8] Miwa K, Nakamura J, Hamada Y, et al. The role of polyol pathway in glucose-induced apoptosis of cultured retinal pericytes [J]. Diabetes Res Clin Prac, 2003,60(1):1-9.

　　[9] Frank RN. On the pathogenesis of diabetic retinopathy [J]. Ophthalmology,1984,91(6)：626-634.