细胞凋亡及其与干眼症相关关系研究进展

　　作者：金龙山，卢迪 作者单位：(延边大学附属医院 眼科，吉林 延吉 133000)

　　【关键词】 细胞凋亡;干眼症;凋亡小体

　　细胞凋亡的概念最早于1972年由kerr提出[1]，即由基因控制的主动性及程序化细胞死亡，特点是细胞核及细胞质浓缩而形成凋亡小体，继而被吞噬细胞或邻近细胞吞噬并消化.目前，普遍认为细胞凋亡是维持机体内组织保持正常生理功能的有益机制，但不恰当的细胞凋亡也可引起众多疾病.研究结果表明，泪腺腺泡细胞、结膜上皮细胞及角膜细胞的凋亡在干眼症的发病中起重要作用.

　　1 细胞凋亡相关蛋白

　　细胞凋亡是多蛋白严格控制的过程.随着分子生物学技术的发展，对多种细胞凋亡的过程有了较为深入的认识，但凋亡过程的确切机制尚不清楚.细胞凋亡是主动过程，涉及一系列蛋白的激活、表达及调控等，而caspase家族蛋白，Bcl2家族蛋白和p53蛋白等在凋亡的信号转导中扮演着重要角色.

　　1.1 Bcl2家族蛋白 Bcl2家族蛋白包括两类功能相反的蛋白质，一类是抑制细胞凋亡的蛋白，如Bcl2,BclxL,Bclw等，另一类是促进细胞凋亡的蛋白，如Bax,Bak,Bad等[2].Bcl2较早被发现，是主要的抑制细胞凋亡的基因，是新的癌基因，被认为是细胞凋亡蛋白家族中最重要的调控蛋白[3].Bcl2蛋白与Bax蛋白形成一对正负调控对，其比例决定细胞是否接收凋亡诱导信号.研究结果表明，高表达Bcl2可抑制细胞内质网钙离子释放，从而抑制细胞凋亡，而Bax基因本身并不直接诱导细胞死亡，但可明显加速死亡信号而引起的细胞凋亡.Bax高表达亦可拮抗Bcl2的凋亡抑制活性，但此效应不因Bcl2高表达而加强[4].

　　1.2 p53肿瘤抑制蛋白 p53在维持蛋白组的完整性中起着重要的作用.p53作为转录因子对DNA损伤做出反应，并诱导下游蛋白(如p21，Mdm2，Bax)的表达，而这些下游蛋白可调节细胞周期和凋亡.p53介导凋亡的机制可能与以下几点有关：在凋亡过程中线粒体膜失去完整性，细胞色素C释放入胞浆，引起caspase断裂而被激活;抗凋亡蛋白Bcl2和促凋亡蛋白Bax可调节细胞色素C释放;Bax的促进子内存在某些p53结合位点，调节对DNA损伤的上调反应[5].p53介导的细胞凋亡可被Bcl2/Bclx抑制，而活性氧是线粒体损伤和凋亡的有力的激活剂，许多蛋白可增加活性氧的产生，因此氧化应激反应可被p53诱导[6].Fas通过FasL三聚化作用被激活继而导致caspase激活，而Fas过度表达可引起凋亡且被认为是p53依赖的，但其机制尚不清楚[7].

　　1.3 caspase蛋白酶 是半胱氨酸基天冬氨酸的特异性蛋白酶，即半胱氨酸天冬氨酸酶.到目前为止，在小鼠和人类体内已经发现至少有14个caspase家族成员.细胞内合成的caspase以无活性的酶原状态存在，经活化后方能执行其功能，而caspase的活化是有顺序的多步骤水解过程.caspase通过adaptor被募集到特定的起始活化复合体，形成同源二聚体构像改变，导致同源分子之间的酶切而被活化.通常caspase8，10，2介导死亡受体通路的细胞凋亡，分别被募集到Fas和TNFR1死亡受体复合物，而caspase9参与线粒体通路的细胞凋亡，被募集到由Cyt c/d及ATP/Apaf1组成的凋亡体，再激活caspase3,6,7，最终导致细胞凋亡[89].

　　2 眼部细胞凋亡与干眼症

　　2.1 泪腺腺泡细胞凋亡与干眼症 近年来研究结果表明，干燥综合征是腺体细胞凋亡及相关基因表达异常的自身免疫性疾病.Kong等[10]认为，干燥综合征患者唾液腺腺泡、导管上皮细胞及浸润淋巴细胞的凋亡是导致干燥综合征患者腺体损伤原因之一.Kunert等[11]对比狗眼的泪腺腺泡、结膜上皮细胞及眼部淋巴组织中的淋巴细胞的凋亡，结果发现正常泪腺和结膜上皮细胞存在局灶性的轻度凋亡，而KCS狗p53,Fas,FasL等基因呈高表达，而Fas与其配体FasL结合后通过FADD和Daxx 2条独立的途径诱导细胞凋亡.研究结果表明，干燥综合征患者唾液腺泡及导管上皮细胞的Fas及FasL蛋白的阳性表达均显著增加，认为Fas介导的细胞凋亡途径是导致干燥综合征患者唾液腺损坏的原因之一[10].目前，已发现了数个与Bcl2同源的基因，如Bax,Bclx,Bad,Mcl等基因，构成了Bcl2基因家族.Bax蛋白可促进细胞凋亡，对抗Bcl2蛋白抑制细胞凋亡的作用[12].

　　2.2 结膜上皮细胞凋亡与干眼症 目前有研究发现，干眼症患者的结膜上皮和泪液中各种炎性细胞因子，如IL1，6，8和生长因子等表达增强，提示免疫型炎症是干眼症的重要发病诱因[13].Brignole等[14]研究HLA DR,CD40,Fas,APO2.7等炎症和凋亡相关因子的表达，发现正常眼和KCS眼比较，Fas,APO2.7表达明显降低，KCS患者的CD40及其配体表达明显强于正常人，提示对干眼症患者而言，炎症常是始发因素，引起泪腺功能障碍，泪液分泌减少.

　　2.3 角膜细胞凋亡与干眼症 Wilson等[15]采用反转录聚合酶链反应技术和免疫组织化学技术测定出Fas及其配子在角膜上皮、基质和内皮细胞中均有表达.在人角膜新鲜冰冻切片中Fas蛋白表达于上皮、基质和内皮细胞，而Fas配子蛋白仅在上皮及内皮细胞中表达，基质细胞中则未见表达，提示Fas配子可调节基质细胞的功能.Yeh等[16]发现，眼表试验性干眼症可引起角膜中心和周边上皮细胞、结膜上皮细胞、结膜基质普遍性凋亡，提示细胞凋亡在干眼症发病中可能起着关键作用.p53基因是肿瘤抑制基因，可促进细胞凋亡.Pokroy[17]在C57BL/6小鼠全眼组织均发现有p53的表达，其中以角膜、结膜及晶状体中表达率较高，提示p53可能参与了眼表细胞的凋亡.

　　3 眼表细胞凋亡检测方法

　　随着各种检测技术的普遍提高和对细胞凋亡认识的不断深入，细胞凋亡检测技术日趋成熟.一般可将检测方法分为细胞凋亡的形态学、生物化学(DNA片段)、流式细胞仪(FCM)及细胞凋亡酶学检测等.

　　3.1 细胞凋亡的形态学检测 在普通光学显微镜下可观察到凋亡细胞外观皱缩，细胞体积变小.但对于一般组织切片，用光学显微镜较难观察到凋亡小体等典型的凋亡形态，本方法只适用于凋亡的初步观察.荧光显微镜下观察凋亡细胞的方法操作简单，可见凋亡细胞核染色质黄绿色荧光浓聚在核膜内侧，细胞核的形态较易辨认，但此法不适用于早期细胞凋亡.利用透射电子显微镜，可清晰地观察细胞凋亡超微结构的改变，但它只能定性，不能定量，且标本处理过程复杂，费用高[18].

　　3.2 DNA分子水平检测 常见方法有凝胶电泳和原位切口末端标记法(TUNEL法).凝胶电泳检测法是根据细胞凋亡时细胞核内DNA发生有规律的断裂，形成大小为180～200bp的寡核苷酸片断，电泳时呈现典型的阶梯状条带，而坏死细胞的DNA断裂点无规律性，电泳时呈现模糊的连续性条带，利用此特征可确定群体细胞的凋亡[19].该法简便，费用低，但仅能对细胞凋亡进行定性而不能定量.TUNEL法操作简单，可检测出极低量的凋亡细胞，在细胞凋亡研究中被广泛应用，但它仅可用于晚期细胞凋亡[20].

　　3.3 膜联蛋白法 根据早期凋亡细胞磷脂酰丝氨酸(PS)外转，可与被荧光素标记的膜联蛋白V标记，而坏死细胞表面可出现PS，而PI可通过坏死细胞，故将两者结合应用可区分正常、凋亡及坏死细胞[21].膜联蛋白法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更灵敏，操作快速，结果可靠，是目前最为理想的细胞凋亡检测方法.

　　3.4 细胞凋亡酶学检测 由于caspase家族在介导细胞凋亡过程中起着非常重要的作用，而其中的caspase3在凋亡早期被激活，故caspase3可作为早期凋亡的检测指标，在凋亡晚期，caspase活性下降，不易检测出caspase3[22].总之，膜联蛋白V/PI,caspase3， TUNEL法均可通过流式细胞分析来实现，既可对细胞凋亡定性又可定量，且具有操作简单，快速，灵敏等许多优点.

　　【参考文献】

　　[1] 张文根,张学英.研究程序化细胞死亡的科学方法[J].细胞生物学杂志,2004，26：257.

　　[2] Chang SF, Sun YY, Yang LY, et al..Bcl2 gene family expression in the brain of rat offspring after gestational and lactational dioxin exposure [J].Ann N Y Acad Sci,2005,1042:471.

　　[3] Tsukahara S, Yamamoto S, TinTinWinShew, et al..Inhalation of lowlevel formaldehyde increases the Bcl2/Bax expression ratio in the hippocampus of immunologically sensitized mice [J].Neuroimmunomodulation,2006,13(2):63.

　　[4] Chami M, Prandini A, Campanella M, et al..Bcl2 and Bax exert opposing effects on Ca2+ signaling,which do not depend on their putative porforming region[J].J Biol Chem,2004,279:54581.

　　[5] Lotem J, PeledKM, Groner Y, et al..Cellular oxidative stress and the control of apoptosis by wildtype p53 cyto toxic compounds and cytokines[J].Proc Natc Acad Sci USA,2006(93):9166.

　　[6] Johnson TM, Yu ZX, Ferrans VJ, et al..Reactive oxygen species are downstream mediators of p53 dependent apoptosis [J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,93(21):11848.

　　[7] Owenschaub LB, Zhang W, Cusack JC, et al..Wildtype human p53 and a temperature sensitive mutant induce Fas/APO1 expression [J].Mol Cell Biol,1995,15(6):3032.

　　[8] Thornberry NA, Lazebnik Y.Caspases;enemies within[J].Science,1998,281(5381):1312.

　　[9] Tsujimoto Y, Finger LR, Yunis J, et al..Cloning of the chromosome breakPoint of neoplastic B cells with the t (14:18) chromosome trathslocation[J].Science,1984,226(4678):1097.

　　[10] Kong L, Oawa N, Nakabayashi T, et al..Fas and Fas ligand expression in the salivary glands of patients with primary sjogren’s syndrome[J].Arthritis Rheum,1997,40(1):87.

　　[11] Kunert KS, Tisdale AS, Gipson IK.Goblet cell numbers and epithelial prolial proliferation in the conjunctive of patients with dry eye syndrome treated with cyclosporine[J].Arch Ophthalmol,2001,120(3):330.

　　[12] Krajewski S,Krajewska M,Shabaik A, et al..Immunohistochemical determination of in vivo distribution of Bax,a dominant inhibitor of Bcl2[J].AM J Pathol,1994,145(6):1323.

　　[13] Briqnole Pisella PJ, Goldschild M, De Saint Jean M, et al..Flow cytometric analysis of inflammatory markers in conjunctival epithelial ceils of patients with dry eyes[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2000,41(6):1355.

　　[14] Brignole F, Pisella PJ, De Saint Jean M, et al..Flow cytometric analysis of inflammatory markers in KCS: 6month treatment with topical cyclosporin A[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2001,42(1):90.

　　[15] Wilson SE, He YG, Loyds SA, et al..The FasFas ligand system and other modulators of apoptosis in the cornea[J].Invest Ophthalmol Vis Sic,1996,37(8):1582.

　　[16] Yeh S, Song XJ, Farleg W, et al..Apoptosis of ocular surface cells in experimentally induced dry eye[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2003,44(1):124.

　　[17] Pokroy R.p53 expression in the normal murine eye[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2002,43(6):1736.

　　[18] 王盛兰，钟延丰，管增伟，等.电镜和荧光显微技术在细胞凋亡研究中的应用[J].北京大学学报 医学版，2003，35(1)：91.

　　[19] Herrmann M, Lorenz HM, Voll R, et al..A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments [J].Nucleic Acids Res,1994,22(24):5506.

　　[20] Pavlovsky Z, Vagunda V.Apoptosisseleded methods of detection of apoptosis and associated regulatory factors on tissue sections of tumors [J].Cesk Patol,2003,39(1):6.

　　[21] Chen GG, Sin FL, Leung BC, et al..Glioblastoma cells deficient in DNAdependent protein kinase are resistant to cell death [J].J Cell Physiol,2005,203(1):127.

　　[22] Philchenkov AA.Caspases as regulators of apoptosis and other cell fanctions [J].Biothemistry (Mose),203,68(4):365.