促红细胞生成素对兔慢性高眼压模型视网膜神经节细胞的保护作用

　　作者：刘冠禹， 杨炜 作者单位：(新疆石河子大学第一附院眼科， 新疆石河子832000)

　　【摘要】 目的探讨促红细胞生成素(EPO)对兔慢性高眼压模型的视网膜神经节细胞的保护作用。方法新西兰大白兔35只，随机分为3组，Ⅰ组：正常对照组5只;Ⅱ组：治疗组即促红素玻璃体注射组15只;Ⅲ组：损伤组15只。Ⅱ组和Ⅲ组左眼前房注射卡波姆眼液制成慢性高眼压模型，schiotz眼压计测量眼压。Ⅱ组制模成功后开始向玻璃体腔注射rHuEPO 3 μl 3 000 U/ml，每周1次，连续3周。每组取10只眼球固定后行石蜡切片，做HE染色及TUNEL染色，检测各组实验结果。结果与Ⅰ组相比较，Ⅱ组和Ⅲ组模型眼的视网膜神经节细胞数明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05);与Ⅲ组比较，Ⅱ组模型眼视网膜神经节细胞数多于Ⅲ组模型眼，差异具有统计学意义(P<0.05);TUNEL染色Ⅱ组和Ⅲ组模型眼视网膜神经节细胞凋亡数均高于对照眼，差异具有统计学意义(P<0.05);Ⅱ组模型眼TUNEL染色视网膜神经节细胞凋亡数少于Ⅲ组模型眼，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论促红细胞生成素对兔慢性高眼压模型的视网膜神经节细胞有保护作用。

　　【关键词】 青光眼; 视网膜神经节细胞; 促红细胞生成素

　　Neuroprotection of erythropoietin on rabbit retinal ganglion cells in

　　chronic ocular hypertension

　　LIU Guanyu, YANG Wei

　　(Department of Ophtalmology, Shihezi University, Shihezi 832000, China)

　　Abstract: ObjectiveTo explore the neuroprotection of erythropoietin on rabbit retinal ganglion cells in chronic ocular hypertention model.Methods35 rabbits without eye diseases were randomly divided into 3 groups：group Ⅰ：normal group(5 rabbits)，group Ⅱ：erythropoietin treated group (15 rabbits)，group Ⅲ：balanced salt solution treated group (15 rabbits).Rabbits in group Ⅱ and Ⅲ were induced with left eye by forcing pefusion of balanced salt solution into the anterior chamber as chronic ocular hypertenfion model.Right eyes were self-control eyes.No standard eyeballs were discarded and l0 eyeballs were selected and fixed in each group.(The retinal ganglion cells were detected by HE staining .The apoptosis cells were detected by TdT-dUDP terminal nick end-labeling (TUNEL) technique.ResultsThe RGCs quantity of model eyes in group Ⅱ and Ⅲ were less than that of group Ⅰ and self-control eyes，there were significant diferences (P<0.05).But the RGCs quantity of model eyes in group Ⅱ were more than that of group Ⅲ， there were significant diferences (P<0.05).The TUNEL-positive cells of model eyes in group Ⅱ and Ⅲ were more than that of group Ⅰ and self-control eyes， there were significant diferences (P<0.05). But the TUNEL-positive cells of model eyes in group II were less than that of group Ⅲ， there were significant diferences (P<0.05). Condusionerythropoietin could provide neuroprotection for RGCs in rabbit chronic glaucoma model.

　　Key words： glaucoma; retinal ganglion cells(RGCs); EPO

　　青光眼是一种常见的不可逆性致盲眼病，其致盲率仅次于白内障，而位居第二位[1]。以视神经凹陷性萎缩和视野缺损为特征，其发病机制尚未完全清楚[2]，目前公认的有两种学说：一是机械学说——强调视神经纤维直接受压、轴浆流中断的重要性;二是缺血学说——强调视神经供血不足，对眼压耐受性降低的重要性。一般认为青光眼视神经损害的机制很可能为机械压迫和缺血的共同作用。无论是哪种机制作用的结果均导致了视网膜神经节细胞的凋亡，以及伴随而来的视功能进行性丧失。近年来，大量的研究显示促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)和促红细胞生成素受体(erythropoietin receptor，EPOR)在神经系统上有功能表达，在体外培养及动物实验中都显示了显著的视神经保护功能。重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)在急性高眼压视网膜缺血再灌注损伤模型[3]和视神经切断损伤模型[4]中的神经保护作用已被证实。本实验通过研究rHuEPO对兔慢性高眼压模型的视网膜神经节细胞的保护作用,探讨EPO用于青光眼视神经保护治疗的基础和可能性。

　　1材料与方法

　　1.1实验动物健康新西兰大白兔35只(青岛市药品检验所动物实验中心提供)，体重2～3 kg，兔龄12～16个月，雌雄不限，无眼部疾患，购自新疆医科大学动物实验室。

　　1.2实验仪器及主要试剂schiotz眼压计。rHuEPO购自Sigma生物技术公司。卡波姆940(上海申兴制药厂)及地塞米松注射液配成3 g/L复方卡波姆溶液(含0.25 g/L地塞米松)，5 μl微量进样器。TUNEL试剂盒(美国Promega公司)。

　　1.3实验分组慢性高眼压模型的建立及分组：Ⅰ组(正常对照组):5只;Ⅱ组(治疗组):即促红素玻璃体注射组,15只;Ⅲ组(损伤组):15只。Ⅱ组和Ⅲ组左眼前房注射卡波姆眼液制做慢性高眼压模型。10 g/L的丁卡因眼液表面麻醉后schiotz眼压计连续测量眼压3 d，1次/d，所有兔双眼眼压均低于2.27 kPa(1 kPa=7.5 mmHg)，均可采用。

　　1.4实验方法Ⅱ组、Ⅲ组在前房注入复方卡波姆溶液建立慢性高眼压模型前，先在对侧角膜缘穿刺，形成一个针孔，因为注入复方卡波姆溶液过程中，眼内容物突然增加，会造成眼内压急剧升高，房水在过高的压力下会自动从此针孔中渗漏出，防止兔眼角巩膜扩张。慢性高眼压模型以眼压升高大于2.93 kPa，并能持续1周为标准[5]。新西兰兔行全身麻醉后，Ⅱ组、Ⅲ组兔左眼点10 g/L丁卡因眼液表面麻醉，眼角膜缘用1 ml注射器穿刺，形成一个针孔，然后在穿刺口对侧的角膜缘穿刺抽出房水约0.2 ml，换针管注入0.2 ml的3 g/L复方卡波姆溶液，测量眼压1次/d，眼压在2.93 kPa以上，维持3 d后Ⅱ组左眼玻璃体内注射rHuEPO，用5 μl微量进样器从角巩膜缘后2～3 mm进针，避开晶状体，斜向后进入玻璃体内注药：rHuEPO组3 μl(3 000 U/ml)，每周1次，连续3周。实验过程中每周测量眼压3次。实验结束后兔耳缘静脉注入空气10 ml处死动物，迅速摘除眼球，去除晶状体和玻璃体。4%缓冲甲醛溶液固定，经视盘与神经纤维走行方向垂直纵向剖开，梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋。用医学图像分析管理系统在400倍视野下，每组2张切片HE染色，其余切片TUNEL染色，每张切片随机选取10个视野，对结果进行分析。

　　1.5统计学处理所有数据均采用SPSS13.0统计学软件进行处理，实验数据以(±s)表示，3组各测定指标的总体比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用SNKq检验,检验水准α=0.05。

　　2结果

　　实验兔左眼前房注入复方卡波姆溶液后，造模3 d后眼压均维持在2.93 kPa以上，随高眼压持续时间的延长眼压进行性升高，并持续2～3周。3周后随高眼压持续时间的延长眼压进行性降低。实验期间模型眼的眼压为(4.47±1.41) kPa，峰值为6 kPa;对照眼的眼压为(2.08±0.25) kPa。

　　2.1兔视网膜组织学观察400倍光镜下，每张切片随机取10个视野，HE染色观察视网膜神经节细胞，Ⅰ组对照眼视网膜神经节细胞呈单层排列，细胞大小不一，轮廓不规则，核深染，细胞边界清晰，细胞排列整齐紧密(图1)。Ⅱ组模型眼视网膜神经节细胞数目减少，形态大致正常，内外核层出现少量细胞丢失，局部有轻度空泡样改变，内核层厚度与对照眼无明显区别(图2)。Ⅲ组模型眼光镜下可见视网膜神经节细胞数目明显减少，视网膜神经节细胞层呈空泡样改变，部分细胞出现核溶解、核染色浅淡、胞浆染色浅淡(图3)。

　　2.2TUNEL原位凋亡检测400倍光镜下，每张切片随机取10个视野观察RGCs凋亡情况，TUNEL染色阳性的RGCs在3组动物眼球的切片上均可检测到，RGCs凋亡的阳性细胞主要表现为细胞核染色呈棕褐色，阴性细胞呈蓝色。Ⅰ组对照眼及Ⅱ、Ⅲ 组的正常眼TUNEL染色阳性细胞数最少，细胞圆形或椭圆形，染色较浅。Ⅱ、Ⅲ组模型眼的切片上TUNEL染色阳性细胞数均高于Ⅰ组对照眼及正常眼(P<0.05)，细胞体积减小，染色较深。Ⅱ组模型眼TUNEL染色阳性细胞数少于Ⅲ组模型眼阳性细胞数(P<0.05),见表1。表1TUNEL染色阳性细胞数

　　3讨论

　　临床上青光眼患者虽然经药物或手术降低了眼压，但RGCs的凋亡、视神经的损伤常常继续发展。甚至导致视力丧失[6]。因此在控制眼压的同时，阻断或降低RGCs的凋亡和增加RGCs的存活能力，已成为青光眼治疗的研究方向[7]。Quigley等[8]用猴和兔做成实验性青光眼模型，并用光、电镜观察以及TUNEL法、DNA电泳等方法引起RGCs死亡，并发现死亡的神经节细胞表现出凋亡的形态学变化：染色体浓缩，凋亡小体形成，并有TUNEL阳性细胞，此结果有力地支持了青光眼RGCs的凋亡。促红细胞生成素是一种含唾液酸的糖蛋白，主要来源于肾脏和肝脏，EPO及其受体在其他几个非造血系统的组织和细胞中也有表达，包括中枢神经系统、上皮细胞、肝脏、子宫、阴茎、前列腺和实体瘤等[9-10]，EPO和EPOR均是早期胚胎神经发育的重要因素，而且EPOR对成体神经发生和在既往损伤修复中再生神经迁移也很重要[11]。动物实验证明，EPO可以通过血脑屏障和血视网膜屏障，具有神经保护和促进神经元再生的双重作用[12-13]。在眼科，EPO的神经保护作用对治疗这些疾病有一定的实际意义。Bigot等[14]发现在晶状体、角膜上皮、光感受器的内段、内核层、神经节细胞层均有EPO和EPOR的表达。近年对EPO及其受体在眼科的研究主要集中在其对视网膜神经元的作用上。本研究通过建立兔慢性高眼压模型发现，损伤组RGCL中凋亡神经细胞数为(10.82+0.98)个/高倍视野，较正常对照组RGCL中神经细胞明显增加;玻璃体内注射rHuEPO后，RGCL中凋亡神经细胞数明显减少为(3.99±0.26)个/高倍视野，以此推断玻璃体内注射rHuEPO对慢性高眼压RGCL神经元损伤同样具有保护作用。rHuEPO可通过血视网膜屏障，提供了全身应用EPO进行视神经保护的有利依据。rHuEPO在急性高眼压缺血再灌注模型、视神经切断模型以及慢性高眼压损伤模型中的视网膜视神经保护作用也已证实，rHuEPO可能将为急性和慢性青光眼、视网膜缺血和视神经损伤等眼科疾病提供新的治疗途径[15]。但如果将EPO作为神经保护药长期使用，也有一些副作用，如血液粘滞性升高、血小板聚集、红细胞增多、血压增高等[16]。有研究者将rHuEPO酶解成asialoEPO，有神经保护功能而没有促红细胞生成的作用[17], 对于眼科来说，还可以将EPO用于局部治疗来减轻其副作用[18]。因而有必要进一步识别和分离rHuEPO的促红细胞生成和视神经保护功能的抗原决定簇，并对其信号转导作用机制进行研究，选择性应用其视神经保护效应，而阻断其红细胞生成效应。仅保留rHuEPO分子的视网膜神经保护活性多肽的重组将会有广泛的临床应用前景。

　　【参考文献】

　　[1]Quigley，Hary A.Number of people with glaucoma worldwide[J].British J Ophthalmol，1996,80(5):389.

　　[2]惠延年.眼科学[M].第6版.北京：人民卫生出版社，2004：132.

　　[3]Junk AK，Mammis A，Savitz SI，et al.Erythropoietin administration protects retinal neurons from acute ischemiareperfusion injury[J].Proc Natl Acad Sci USA ,2002,99(16)：1065910664.

　　[4]Eid T，Brines M.Recombinant human erythropoietin for neuroprotection：what is the evidence[J].Clin Breast Cancer ,2002,3(suppl 3)：109115.

　　[5]徐岩，陈祖基,宋洁贞.复方卡波姆诱发的兔高眼压模型与其它兔高眼压模型的比较研究[J].中华眼科杂志,2002，38(3)：172175.

　　[6]Yang J.Tezel G.Serum autoantibody against glutathione Stransferase in patients with glaucoma[J].Invest Ophthalmol Vis Sei，2001，42：12731276.

　　[7]Wax B，Tezel G，Eduard PD.Clinical and ocular histopathological findings in a patient with normalpressure glaucoma[J].Arch Ophthalmol，1998，116：9931001.

　　[8]Quigley HA，Niekells S.Retinal ganglion cell death in experimental glancoma and after axotomy OCCUrs by apoptosis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1995,36:774.

　　[9]Farrell F，Lee A.The erythropoietin receptor and its elpression in tumor cells and other tissues[J].Oncologist，2004，9(suppl 5)：1830.

　　[10]Lju T，Allaf ME, Lagoda G，el al.Erythropoietin receptor expression in the humman urogenital tract：immunolocalization in the prostate， neurovascular bundle and penis[J].BJU Int，2007，100：11031106.

　　[11]Tsai PT，Ohab JJ，Kertesz N，el al.A critical role of erythmpoietin receptor in neurogenesis and poststroke recovery[J].J Neurosci，2006，26：12691274.

　　[12]Weishaupt JH，Rohde G，Polking E，et al.Effect of erythropoietin axotomyinduced apoptosis in rat retinal ganglion cells[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2004,45：15141522.

　　[13]Gonzalez FF，McQuillen P，Mu D，el al.Erythropoietin enhances longterm neuroprotection and neurogenesis in neonatal stroke[J]. Dev Neurosci,2007,29：321330.

　　[14]Bigot K，Perez E，Gadin S，et al.Effect of systemic erythropoietin treatment on photoreceptors degeneration of RCS rats[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2004,45:3583.

　　[15]Wang JM, Song YP，Sun NX，et al. Protection of systemic recombinant human erythropoietin on the ultrastructure of retina and optic nerve in an acute high intraocular pressure rabbit model[J].Int J Ophthalmol，2008,8(11)：22212223.

　　[16]Wiessner C, Allegrini PR, Ekatodramis D, et al. Increased cerebral infarct volumes in polyglobulic mice overexpressing errthropoietin[J].J Cereb Blood Flow Metab,2001,21:857864.

　　[17]Erbayraktar S, Grasso G, Sfacteria A. Asialoerythropoietin is a nonerythropoietic cytokine with broad neuroprotective activity in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100:67416746.

　　[18]Junk AK,Mammis A,Savitz SI,et al.Erythropoietin administration protects retinal neurons from acute ischemiareperfusion injury[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99:1065910664.