应用台盼蓝-茜素红联合染色实时观察晶状体上皮细胞形态与活性的研究

　　作者：段海 管怀进 作者单位：南通大学附属医院眼科中心，南通226001

　　【摘要】 目的：探讨台盼蓝-茜素红染色应用于晶状体上皮细胞形态及活性研究的可行性。方法：取大耳白兔、正常人、白内障患者的晶状体前囊膜，行台盼蓝-茜素红染色，光镜下观察细胞的形态、染色效果并判断其活性。结果：兔、正常人、白内障患者晶状体上皮细胞通过台盼蓝-茜素红联合染色均可获得良好的染色效果。光镜下可清楚显示晶状体上皮细胞的形态并能区分正常与死亡的细胞。结论：台盼蓝-茜素红活性染色可用于观察晶状体上皮细胞的形态、密度、面积以及细胞的活力，是研究晶状体上皮细胞的一种良好而实用的方法。

　　【关键词】 晶状体上皮细胞 台盼蓝 茜素红 活性染色

　　Morphological and vital study of lens epithelial cells using

　　the trypan-blue and alizarin red staining

　　DUAN Haixia, GUAN Huaijin (Department of Ophthalmology, Affiliated Hospital, Nantong University, Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: To assess the feasibility of trypan-blue and alizarin red vital staining to lens epithelial cells. Methords: Anterior lens capsules of rabbits, health adults and patients with cataracts were stained by trypan-blue and alizarin red, then observed the cellula appearance and the effectiveness of the staining on light microscope. Results: There were favourable effectiveness of the staining. Trypan-blue and alizarin red vital staining was capable of displaying the cellula appearance and distinguishing the normal and abnormal cells. Conclusion: Trypan-blue and alizarin red vital staining refer to lens epithelial cells, which was a practical methord to observe the morphology, density, area and the cellula vis vitalis.

　　[Key words] Lens epithelial cells;Trypan-blue; Alizarin red; Vital staining

　　台盼蓝染色法是鉴定细胞活力最常用的方法之一。Spence等(1976年)认为该染色法在眼科也是评价角膜内皮活力最常用的方法。由于该法不能显示出细胞轮廓，故难以判定细胞死活的比例。茜素红能使细胞间质的钙着色，故可清晰地显示细胞的轮廓，这对于了解角膜内皮细胞的形态和结构非常有益。运用茜素红联合台盼蓝染色可成功显示出角膜内皮细胞及其活性，使角膜内皮细胞的研究迈出了一大步。晶状体上皮细胞(lens epithelial cells, LECs)是白内障研究的焦点，现有的HE细胞染色法难以满足LECs形态学研究的需要特别是细胞的实时活性观察。为此我们将茜素红台盼蓝联合染色法应用于晶状体上皮细胞，以期探索一种新的、更好的LECs形态及活性研究方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 (1)正常人透明晶状体前囊膜：3例均来源于急性外伤死亡5小时以内的正常人透明晶状体，年龄20~25岁。手术显微镜下，剪除角膜和虹膜，暴露晶状体，自制截囊针于晶状体11点处做一开口，用囊膜剪切一4mm×4mm大小的中央区前囊膜，并留前囊膜下端与残留晶体囊袋相连，翻转前囊膜内面朝外。(2)大耳白兔晶状体前囊膜：10只，兔龄3~4个月，体重2~2.5kg。兔耳缘静脉空气栓塞处死后迅速摘除眼球，晶状体前囊膜制备方法同正常人晶状体前囊膜。(3)老年性白内障晶状体前囊膜：30例，皮质性，年龄41~85岁，平均67.9岁。取白内障超声乳化手术中连续环形撕囊获得的前囊膜，约4~5mm，所有前囊膜取材后立即进行染色。

　　1.2 染色方法 所有囊膜在制备好后，立即置于玻片上，首先用2.5%台盼蓝染色90秒，生理盐水轻轻漂洗除去染液。1%茜素红复染60秒，生理盐水轻轻漂洗，漂洗后将下端连接处剪开，前囊膜移至预先滴有生理盐水的玻片上。移动时轻轻夹着囊膜边缘，防止对晶状体上皮造成的机械性损伤，且要保证上皮面朝上。空气中自然干燥后，置光学显微镜下观察。具有活性的上皮细胞边界呈红色，核不着色。无活性的上皮细胞表现为边界不清，细胞核呈圆形，蓝色。

　　2 结 果

　　3种来源的晶状体上皮，通过台盼蓝-茜素红活性染色均可获得良好的染色效果。正常人透明晶状体上皮细胞镶嵌型排列，大小形态基本一致。具有活性的上皮细胞呈多角形，轮廓清晰，边界呈红色，核不着色。无活性的上皮细胞表现为边界不清，细胞核染蓝色呈圆形(见图1)。兔晶状体上皮细胞染色同正常人透明晶状体上皮细胞相似，但边界更清楚，大小不十分一致，呈椭圆多角形(见图2)。白内障患者晶状体上皮细胞也呈多角形，但大小形态均不规则，部分区域细胞缺失，另部分区域可见重叠细胞，细胞染色表现为3种情况：(1)细胞边界呈红色，核不着色;(2)细胞边界不清，核呈蓝色;(3)细胞边界不清，核呈红色，且红色核比蓝色核略小(见图3)。

　　3 讨 论

　　台盼蓝-茜素红活性染色是评价角膜内皮细胞活性的一种最常用的方法[1，2]。此方法是通过观察细胞的形态和着色来说明细胞的活性。其中台盼蓝能通过死亡细胞膜使细胞核着染呈蓝色。茜素红是一种神经组织的活性染色剂，依赖细胞间钙的红染反应，可清晰显示具有活性内皮细胞的形态。目前检测LECs活性以及增殖的方法流式细胞仪虽可对单个细胞的DNA合成进行分析，推测细胞活性，计算增殖指数，但价格昂贵，且在做药物作用实验时，由于接触抑制，漂浮死亡细胞的影响易出现一些假象;MTT比色法可用于检测成纤维细胞的增殖活性，但由于上皮细胞面积大，代谢MTT少，比色不明显。结晶紫染色法程序复杂，其在酸性水溶液冲洗时易脱色，结果不稳定。研究LECs形态、密度、面积时人们也常用HE染色法[3，4]，但这种方法不能确定细胞活性。本研究显示3种来源的晶状体上皮，通过台盼蓝-茜素红活性染色均可获得良好的染色效果，台盼蓝-茜素红联合染色不仅可以了解LECs的形态、密度、面积，而且还能检测细胞的损伤及活力情况。

　　此外在本研究中，我们观察到白内障患者LECs经复合染色后，除了正常细胞(细胞边界红染，核不着色)和死亡细胞(细胞核蓝染)外，还有一部分细胞表现为细胞边界不清，核呈红色，且红色核比蓝色核略小。同时在对正常人和兔LECs染色时偶尔也会见到这种表现的细胞。其原因可能是：(1)LECs与其下晶状体纤维存在广泛的缝隙连接[5]，取材时手术撕囊对LECs膜造成轻微的机械性损伤，细胞处于亚健康状态，茜素红分子量小于台盼蓝，而进入细胞与其内的钙发生反应，使细胞核呈红色。因此，手术时应尽量做到无创操作或取材时避开囊膜边缘。(2)蔡兆明等[6]观察白内障晶状体上皮，发现多数细胞膜破裂，并认为其原因可能是相邻细胞顶部的紧密连接缺失，房水入侵所致。细胞膜的破裂使分子量小的茜素红进入细胞，细胞核红染，但具体原因有待进一步研究。

　　总之，台盼蓝-茜素红活性染色方法操作简单、节省时间，不需特殊设备、花费少，结果清晰、易于判断和计数，并通过这种方法，可以直接在组织上实时判断药物对LECs有无毒性，是观察LECs的形态、密度、面积以及细胞活力的一种实用方法。

　　【参考文献】

　　[1] Liou SW, Chiu CJ, Wang JJ, et al. Effect of intracameral injection of lidocaine and carbachol on the rabbit corneal endothelium[J]. J Cataract Refract Surg, 2004, 30:1351-1355.

　　[2] 管怀进,龚启荣，主编.现代基础眼科学[M].北京:人民军医出版社,1998：620.

　　[3] 张 虹,李贵刚,谢二娟.不同类型白内障晶状体上皮细胞密度分析[J].眼科新进展,2003, 23:245-247.

　　[4] 柳夏林，刘奕志，刘欣华，等.老年性白内障的不同类型与晶状体上皮细胞密度的改变[J].中山医科大学学报,2002,23:50-52.

　　[5] 高宇端.晶状体细胞缝隙连接的结构、性质及功能[J].国外医学眼科学分册,2004,28：241-244.

　　[6] 蔡兆明,陈瑞华,康仲涵,等.白内障晶状体上皮细胞及晶状体纤维超微结构的观察[J].解剖学杂志,1995,18:219-221.