Egr1在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞的表达

　　作者：王静波 惠延年 周健 胡丹 杜红俊 蔡 莉 刘洪雷 崔志利 作者单位：解放军总医院第309临床部眼科，北京 100091

　　【摘要】 观察早期生长反应因子1(Egr1)在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞的表达。方法 用免疫荧光染色法观察25例(26眼)年龄相关性白内障患者和5例健康人的正常透明晶状体上皮细胞Egr1蛋白的表达。结果 在正常透明的晶状体上皮细胞Egr1表达微弱，且主要表达在细胞核内;在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞Egr1的表达明显增高，主要定位于细胞浆。结论 与正常细胞相比，年龄相关性白内障晶状体上皮细胞Egr1的表达显著增强。

　　【关键词】 早期生长反应因子 白内障 上皮细胞 晶状体 免疫荧光

　　早期生长反应因子1(Egr1)是一重要的转录因子，在受到细胞外刺激(如机械损伤、细胞因子、氧化损伤等)后可有快速而短暂表达〔1，2〕。动物学实验发现，紫外线〔3〕和硒〔4〕可上调晶状体上皮细胞Egr1表达。而目前关于Egr1在人类年龄相关性白内障中的表达变化尚未见报道。本实验中，我们采用免疫荧光染色法观察Egr1在年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞的表达变化，以探讨其在该病发病机制中的作用及意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　年龄相关性白内障的诊断标准参见文献〔5〕。选择研究对象时，排除曾患葡萄膜炎、青光眼等眼部疾病和眼外伤史的患者，排除年龄以外的其他因素引起的白内障。收集行白内障摘除手术的年龄相关性白内障的连续患者25例(26眼)，男12例(12眼)，女13例(14眼)。年龄30～84(平均63.77±12.35)岁。术中通过连续环形撕囊获得晶状体前囊膜，立即于4%多聚甲醛中固定30 min，放入-70℃低温冰箱中保存。收集意外死亡的健康青壮年5例(5眼)，年龄25～40岁。取角膜移植片后，连续环形撕囊获得晶状体中央直径5～6 mm的前囊膜，处理方法同白内障组。

　　1.2 材料

　　兔抗人抗Egr1多克隆抗体(武汉博士德公司)，异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔IgG(北京中杉公司)。

　　1.3 苏木素-伊红染色

　　取出固定好的组织片，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗;苏木素8 min，流水冲洗;盐酸酒精分化数秒，流水冲洗;伊红 5 min，蒸馏水冲洗;自然晾干，中性树胶封片。光学显微镜下观察晶状体上皮细胞的形态。

　　1.4 免疫荧光染色

　　取出固定好的组织片，PBS漂洗;曲拉通X100室温20 min，PBS漂洗;3%过氧化氢室温15 min，PBS漂洗;兔抗人抗Egr1多克隆抗体(1∶100)湿盒4℃过夜，PBS漂洗;FITC标记羊抗兔IgG(1∶100)湿盒37℃孵育60 min，PBS漂洗。将反应后的晶状体前囊膜贴于载玻片上〔6〕，甘油缓冲液封片。激光共聚焦显微镜观察并照相。设PBS替代第一抗体的空白对照，正常人乳腺组织作为阳性对照。

　　1.5 结果判定

　　激光共聚焦显微镜观察下，以细胞浆和/或细胞核呈绿色为阳性标志。将阳性按荧光强度分为4级：弱阳性，即荧光呈淡绿色;强阳性，即荧光呈浓绿色;中度阳性，即荧光强度介于弱阳性与强阳性之间;阴性，即荧光强度极弱。安排对本实验盲的技术人员观察并记录荧光强度。

　　2 结 果

　　2.1 上皮细胞的形态

　　正常晶状体上皮细胞分布均匀，细胞大小一致，为多角形，细胞间相互嵌合，细胞核为圆形，大小均匀一致。白内障前囊膜下的晶状体上皮细胞一部分与正常透明的晶状体上皮细胞无明显差别，一部分有轻度异常，表现为细胞肿大，细胞间隙加大，细胞核大小不一致，可见到多少不等的细胞重叠现象，一般为1～3个细胞重叠。

　　2.2 Egr1蛋白的表达

　　正常晶状体上皮细胞的5例样本中，2例荧光强度为中度阳性，2例弱阳性，1例阴性。在正常晶状体上皮细胞中，Egr1定位于大多数细胞的细胞核，仅个别细胞的细胞浆呈弱阳性。在白内障前囊膜晶状体上皮细胞的25例(26眼)年龄相关性白内障前囊膜中，晶状体上皮细胞的表达呈强阳性、中度阳性、弱阳性和阴性的分别有3例(3眼，11.54%)，9例(9眼，34.62%)，4例(4眼，15.38%)，9例(10眼，38.46%)。在白内障组，Egr1主要定位于细胞浆内，细胞核表达呈弱阳性或阴性(图1)。

　　3 讨 论

　　Egr1属即刻早期基因家族，该基因定位于人的第5对染色体q2331。细胞中的即刻早期基因能介导细胞的生长与分化，当细胞受到生长因子、离子射线、细胞因子等刺激引起膜去极化时，本来处于休眠状态的即刻早期基因很快被激活，导致细胞的增殖，对细胞生长分化和损伤修复起重要作用。Egr1是一种重要的核转录因子，调控与细胞生长分化和凋亡、炎性细胞趋化、免疫刺激等相关的多种基因表达，与机体损伤修复等过程密切相关〔2〕。

　　在过氧化氢刺激后，人晶状体上皮细胞系CD5A细胞Egr1蛋白的表达增加〔7〕。研究表明，一些DNA损伤的因素，如离子和紫外线照射，可诱导Egr1的表达〔8，9〕。与这些结果一致，本实验表明，年龄相关性白内障的晶状体上皮细胞Egr1蛋白的表达显著增强，这是动物学与体外细胞学实验以外首次报道的Egr1与人类白内障的关系。Maass等〔10〕发现，如果细胞不增殖，则Egr1 mRNA仅有转录，不翻译成蛋白。据此，我们分析，正常晶状体上皮细胞Egr1的核内表达说明细胞有强的转录活性，但未发生增殖;而在白内障的形成过程中，晶状体上皮细胞受到刺激后，Egr1 mRNA翻译成Egr1蛋白，因而该蛋白在细胞浆内表达增强，且同时细胞发生增殖。 综上，我们推测，紫外线照射、氧化损伤、离子射线等多种因素引起晶状体上皮细胞DNA的损伤，这些损伤会刺激细胞中的Egr1 mRNA翻译成Egr1蛋白，从而引起上皮细胞生物学性状的改变，最终形成白内障。但Egr1在这其中的具体机制尚需深入研究。

　　【参考文献】

　　1 Gashler A，Sukhatme VP.Early growth response protein 1(Egr1)：prototype of a zincfinger family of transcription factors〔J〕.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，1995;50:191224.

　　2 Kaufmann K，Thiel G.Epidermal growth factor and plateletderived growth factor induce expression of Egr1，a zinc finger transcription factor，in human malignant glioma cells〔J〕.J Neurol Sci，2001;189(12):8391.

　　3 Wickert H，Zaar K，Grauer A,et al.Differential induction of protooncogene expression and cell death in ocular tissues following ultraviolet irradiation of the rat eye〔J〕.Br J Ophthalmol，1999;83(2)：22530.

　　4 Nakajima T，Nakajima E，Fukiage C,et al.Differential gene expression in the lens epithelial cells from selenite injected rats〔J〕.Exp Eye Res，2002;74(2):2316.

　　5 惠延年.眼科学〔M〕.第5版.北京：人民卫生出版社，2001：98100.

　　6 周 健，惠延年,李 燕，等.波形纤维蛋白在老年性白内障晶状体上皮细胞的表达〔J〕.中华眼科杂志，2001;37(5):3425.

　　7 Paron I，D′Elia A，D′Ambrosio C,et al.A proteomic approach to identify early molecular targets of oxidative stress in human epithelial lens cells〔J〕.Biochem J，2004;378(3):92937.

　　8 Ahmed MM，Venkatasubbarao K，Fruitwala SM,et al.EGR1 induction is required for maximal radiosensitivity in A375C6 melanoma cells〔J〕.J Biol Chem，1996;271(46):292317.

　　9 Huang RP，Adamson ED.A biological role for Egr1 in cell survival following ultraviolet irradiation〔J〕.Oncogene，1995;10(3):46775.