大鼠内层视网膜缺血再灌注损伤所致细胞凋亡的研究

　　作者：李旭 王桂云 张晓光 作者单位：吉林大学第二医院眼科，吉林 长春 130041

　　【摘要】 目的 通过大鼠内层视网膜缺血再灌注(IR)过程中细胞凋亡的检测，探讨视网膜IR的病理机制。方法 采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术，检测大鼠视神经结扎致视网膜中央动脉阻断引起的大鼠内层视网膜IR损伤导致的视网膜细胞凋亡。结果 视网膜细胞凋亡自视网膜IR 3 h后出现，逐渐增多，一直持续存在至 24 h，然后下降，至48 h减少，而在正常和缺血组视网膜上没有凋亡细胞的出现。结论 视网膜IR所引起的病理过程不仅是循环障碍，更是视网膜神经元的变性过程。

　　【关键词】 视网膜;缺血再灌注;凋亡

　　视网膜组织不仅是视觉系统的组成部分，也是神经组织的一部分，对缺血、缺氧的耐受性较差，反应敏感。对脑缺血再灌注(IR)损伤的研究发现，一些神经元具有选择性受损伤能力，大脑中易受损伤的细胞位于皮质的Ⅲ、Ⅴ层和海马回的CA1和CA4区〔1〕。在视网膜组织中相似的现象也在起作用，节细胞可能是敏感的细胞群〔2〕。本实验采用原位凋亡方法，即末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)，检测大鼠视神经结扎致视网膜中央动脉阻断引起的大鼠内层视网膜IR损伤所致的视网膜细胞的凋亡情况，为了解视网膜IR的病理机制，更好的预防缺血所引起的损害奠定理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及模型制备 根据Otori等〔3〕提供的方法，选取45只健康Wistar大鼠(解放军军需大学动物部提供)，雌雄不限，无眼疾，体重在200～250 g之间。将动物随机分为9组，每组5只大鼠。包括正常对照(N)组，缺血组(I)，再灌注(R)3、6、9、12、24、48和72 h组。所有大鼠均采用右眼为实验对象。

　　采用戊巴比妥钠3 ml/kg腹腔麻醉，沿角膜缘环形剪开球结膜，分离结膜下组织，暴露4条直肌及视神经，从4条直肌之间穿过60丝线，使之环绕视神经。

　　N组不结扎丝线;其余各组均用丝线活结结扎视神经，从瞳孔观察眼底血流中断，变苍白，造成视网膜缺血。维持此状态60 min，立即摘除眼球为I组;其余各组松开结扎线，形成再灌注，分别于3、6、9、12、24、48和72 h摘除眼球，分别为R3、R6、R9、R12、R24、R48和R72组。

　　1.2 方法 眼球摘除后，用安全刀片自角膜至视神经纵向剖开，去前节和玻璃体，固定于4%的多聚甲醛溶液中，4℃24 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋成蜡块。所有标本制成5 μm的切片。每例标本间隔100 μm选取1张切片，共4张进行TUNEL染色。组织切片脱蜡至水，0.3% H2O2封闭60 min，滴加蛋白酶K，37℃2 h，加入TUNEL液(即末端转移酶)(鼎国公司)，37℃1 h，马血清封闭，室温60 min，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素37℃1 h保温孵育，用二氨基联苯胺显色。显微镜下观察，细胞核呈棕黄色，细胞膜和浆无明显特异性染色的切片进行阳性细胞计数。

　　1.3 检测指标 400×视野下计数阳性细胞个数，平均每个视野含视网膜节细胞层(ganglion cell layer,GCL)12～24个，共选取5个不同的视野区，计数阳性细胞总数。

　　1.4 统计学处理 结果进入Instat统计学软件，得出IR损伤各个不同时相TUNEL阳性细胞计数，并给出直方图。

　　2 结果

　　在视网膜IR损伤大鼠动物模型的不同时相上，相对于正常对照组视网膜可以观察到TUNEL阳性的细胞，表现为细胞核呈现棕黄色的染色。IR损伤各个不同时相的5个标本的4张不同切片上，随机选取的5个不重复视野的阳性细胞总数见表1。GCL染色IR损伤48 h及INL染色IR损伤3 h阳性细胞数偶见，两种染色IR损伤72 h见不到阳性细胞。

　　2.1 对照组和缺血组TUNEL染色 对照组的视网膜组织上没有TUNEL阳性细胞的表达。在缺血组同样未见到TUNEL阳性细胞。

　　表1 IR损伤各个不同时相TUNEL阳性细胞计数(略)

　　2.2 视网膜GCL染色 在再灌注3 h组，可见GCL细胞出现阳性染色，再灌注6、9 h，阳性细胞数逐渐增多至最高峰，12、24 h阳性细胞数逐渐减少，至再灌注48 h偶尔可见散在的阳性细胞，而再灌注72 h见不到阳性表达(图1、图2)。

　　图1 大鼠视网膜IR 9 h(TUNEL染色，×400)(略)

　　图2 大鼠视网膜IR 24 h(TUNEL染色，×400)(略)

　　2.3 内核层(inner nuclear layer，INL)染色 再灌注6 h组可见INL细胞开始出现阳性染色，随着再灌注时间延长，阳性染色细胞逐渐增多，至再灌注24 h达到高峰，INL层的内侧染色相对明显，48 h再灌注时，TUNEL标记明显减少，再灌注72 h完全消失。TUNEL阳性的GCL和INL细胞定量分析结果见图3。

　　图3 再灌注不同时相TUNEL阳性细胞计数(略)

　　3 讨论

　　原位凋亡检测方法应用的TUNEL技术，对凋亡细胞的标记强度高，敏感性强。本研究报道了TUNEL方法检测的实验性大鼠视网膜IR损伤视网膜内层细胞的凋亡现象。在中枢神经系统中，缺血、缺氧等引起的神经元细胞的死亡起初被认为是坏死，但是最近的一些研究表明凋亡在IR损伤中也起重要作用，瞬时脑IR损伤和局灶性脑缺血的研究发现凋亡参与脑神经元的死亡〔4，5〕。在内层视网膜上可以见到TUNEL阳性的GCL和INL细胞，是神经元细胞的凋亡和变性，而不是血管内皮细胞，表明在视网膜IR损伤过程中存在神经元凋亡，这一现象与其他文献报道相似〔6〕。这些数据表明在视网膜IR早期就有神经元凋亡，神经元变性可以看成是视网膜IR的重要结果，这一结果也支持Gibson〔7〕提出的凋亡在神经元变性中起重要作用这一学说。临床上所观察到的视网膜循环障碍性疾病后期出现的视神经萎缩的现象与此相吻合。同样，视网膜局部变薄，或视网膜神经纤维层缺损也可以在一些视网膜反复缺血的疾病中见到。

　　视网膜细胞凋亡首先出现在GCL层，随后在INL层出现，其中INL层细胞包括双极细胞的胞体，水平细胞，无长突细胞和神经胶质细胞。一方面说明视网膜节细胞对缺血和缺氧的反应最敏感，此过程使神经元的破坏增多，导致视网膜视觉冲动传导过程的第一级和第二级神经元受损;另一方面，也可能存在视网膜神经胶质细胞的凋亡。胶质细胞能诱导大脑中起屏障作用的蛋白质的产生，在视网膜上能够诱使视网膜血管内皮细胞表达紧密连接蛋白〔8〕，因此神经胶质细胞的死亡将导致血管内皮细胞的屏障功能下降，加重视网膜微血管病变。

　　视网膜细胞凋亡自再灌注3 h后出现，逐渐增多，一直持续存在至24 h，然后下降，至48 h减少，至72 h则完全观察不到。由于IR，导致视网膜细胞凋亡的发生，同时由于继发的毒性因素的释放可能加速细胞凋亡。一些研究〔2〕已经证实视网膜IR损伤过程中有谷氨酸代谢的改变，大量未代谢的谷氨酸所引起的毒性反应能够进一步导致神经细胞凋亡;同时，细胞外大量谷氨酸的堆积也说明神经胶质细胞的保护功能下降。

　　因此，视网膜IR损伤引起的疾病的病理过程不仅仅是循环障碍，更是视网膜神经的变性。对这些疾病的治疗应至少包含针对恢复神经变性和改善循环障碍两个方面来进行。

　　【参考文献】

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　　2 Osborne NN，Casson RJ，Wood JP,et al.Retinal ischemia：mechanisms of damage and potential therapeutic strategies〔J〕.Prog Retin Eye Res，2004;23(1):91147.

　　3 Otori Y,Shimada S，Morimura H,et al.Expression of cfos and cjun mRNA following transient retinal ischemia：an approach using ligation of the retinal central artery in the rat〔J〕.Surv Ophthalmol，1997;42 (Suppl1):S96104.

　　4 Smrcka M，Horky M，Otevrel F,et al.The onset of apoptosis of neurons induced by ischemiareperfusion injury is delayed by transient period of hypertension in rats〔J〕.Physiol Res，2003;52(1):11722.

　　5 Mouw G，Zechel JL，Zhou Y,et al.Caspase9 inhibition after focal cerebral ischemia improves outcome following reversible focal ischemia〔J〕. Metab Brain Dis，2002;17(3):14351.

　　6 Zhou Y，Lindner LE，Chiou GC,et al.Transient retinal ischemiareperfusion in rats〔J〕.Chin Med J (Engl)，2000;113：4615.

　　7 Gibson RM.Does apoptosis have a role in neurodegeneration〔J〕?BMJ，2001;322:153940.

　　8 Gardner TW,Lieth E,Khin SA,et al.Astrocytes increase barrier properties and ZO1 expression in retinal vascular endothelial cells〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，1997;38:24237.