微量全氟菲烷眼底残留对兔视网膜电图及超微结构的影响

　　作者：杨成明 胡一多 苏冠方 张丽华 刘早霞 作者单位：吉林大学第二医院眼科，吉林 长春 130041

　　【摘要】 目的 研究微量全氟菲烷眼底残留对兔视网膜电图及超微结构的影响。方法 取成年健康大耳灰兔24只，随机将每只兔的一眼为实验眼,另一眼为对照眼。将试验眼再随机分为视网膜表面组及视网膜下组。兔眼麻醉后外上方角巩膜缘后3 mm处穿刺,赤道部视网膜上造孔后向视网膜下推注0.1 ml全氟菲烷，此为视网膜下组。对于视网膜表面组则不造孔，仅将全氟菲烷注射到视网膜表面。术后定期行检验镜及视网膜电图(ERG)检查后处死并摘除眼球,固定，超薄切片，透射电镜下观察兔视网膜超微结构的改变。结果 检眼镜检查：视网膜未见明显变化;视网膜电图检查：视网膜表面组及视网膜下组与对照组相比，视网膜电图均发生明显变化。透射电镜下观察：实验组除第1天外，其他各时间段视网膜各层细胞显微结构均出现损害。且随着时间的推移，全氟菲烷的损害作用不断加重，且视网膜下组比视网膜表面组损害更重。 结论 微量全氟菲烷残留眼底可对视网膜结构造成损害，且其主要原因还是重水的机械压迫作用，而重水的毒性作用亦不可忽视。

　　【关键词】 全氟菲烷;视网膜电图;电镜

　　全氟化碳液(PFCLS)，又名重水，是玻璃体视网膜手术中重要的玻璃体替代物，迄今为止，在已有的多种玻璃体替代物中，由于其高比重，不溶于水的特性，在眼科的外科手术中得到了广泛的应用，成为玻璃体短期或中期的替代物和内眼流动性组织的工具〔1，2〕。但是，重水的眼内残留仍然是一种严重的手术并发症。很多研究发现，它滞留眼内一段时间对眼组织有一定的毒性，但到目前为止，PFCLS作为玻璃体填充物引起视网膜发生病理性改变的确切原因尚不清楚，且有关微量重水残留对眼组织影响的报道很少。本研究旨在揭示重水对眼底组织的影响，探讨眼底改变的发病机制，为临床应用提供实验根据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 全氟菲烷购自上海博士伦公司;灰兔购自吉林大学动物室。

　　1.2 重水残留模型的建立 取成年健康大耳灰兔24只,雌雄兼用,体重2.0～2.5 kg。随机将每只兔的一眼为实验眼,另一眼为对照眼。将实验眼再随机分为视网膜表面组(12只)及视网膜下组(12只),以速眠新0.1 ml/kg肌肉注射麻醉后，缝线固定上直肌,于颞上象限剪开球结膜,在外上方角巩膜缘后3 mm处,用20 G巩膜穿刺刀刺穿巩膜,显微镜下,伸入27 G前房注射针。在髓线(为兔眼的视盘，呈横椭圆形)下方约1～2 PD处赤道部视网膜上造一小孔,视网膜下缓慢推注0.1 ml的全氟菲烷,可见局部视网膜灰白色隆起，此为视网膜下组;视网膜表面组则在玻璃体临近髓线处视网膜表面注入0.1 ml全氟菲烷;而对照组不做任何处理。用8-0可吸收缝线缝合结膜切口1针,结膜下注射庆大霉素1万单位。术后将兔放入带有头部固定圈的木箱中(防止重水在眼内运动)，每日用氯霉素眼液冲洗术眼，金霉素眼膏涂术眼。术后每日用直接检眼镜检查所有灰兔眼底。分别在术后1、3、7、14 d及1、3个月对4只灰兔(包括视网膜表面组和视网膜下组各2只)行闪光视网膜电图(ERG)检查,然后即刻处死摘除眼球,固定用于组织学检查。

　　1.3 电镜切片的制备 取实验组眼全氟菲烷附近的网膜组织(摘除前已作标记)固定于眼球固定液(2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定)。经酒精系列脱水后,Epon812环氧树脂包埋,LKB-3型超薄切片机做超薄切片,醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，JEM-1200EX型透射电子显微镜观察摄片。

　　1.4 ERG检查 同样方法全身麻醉后,结膜囊内滴1%的倍诺喜眼液进行表面麻醉。结膜囊和角膜接触镜电极内滴入0.5%甲基纤维素溶液后,安放角膜接触镜电极,参考电极用不锈钢针刺入耳根和眼睑之间皮下,接地电极用不锈钢针刺入额部正中皮下。采用全视野弥散光,标准强度白光单次闪光刺激,每只眼记录3次。记录兔眼暗适应视网膜电图b波的潜伏期(Lb)、振幅(Ab)。采用重庆泰克公司生产的电生理记录仪,频带5～1 000 Hz,分析时间200 ms,白色闪光刺激仪,强度为3.32 J,频率1 Hz,叠加3次。

　　2 结果

　　2.1 检眼镜下所见 所有术眼均未出现眼内炎。除1例视网膜下组兔眼由于晶体混浊影响眼底观察外，其余均可用直接检眼镜观察眼底变化。其中对照组玻璃体透明，视网膜呈橘红色反光;视网膜表面组可见全氟菲烷在玻璃体腔内4 w即有乳化和分散成为小滴(鱼卵现象) ，视网膜未见任何明显变化。视网膜下组可见全氟菲烷注射部位局部隆起，余未见明显变化。

　　2.2 ERG检查 实验组中视网膜表面组b波的振幅和对照组相比在7 d后有显著性差异,但潜伏期无显著性差异;同样，视网膜下组b波的振幅和对照组相比在7 d后有显著性差异,但潜伏期亦无显著性差异;而视网膜表面组实验眼b波的潜伏期、振幅和视网膜下组相比无显著性差异(见图1)。

　　2.3 透射电镜下观察

　　2.3.1 视网膜下组术后3 d就出现感光细胞外节盘膜不规则缺损，即“虫咬现象”;7 d时光感受器核减少或移到锥杆细胞层,视网膜色素上皮萎缩、视网膜外核层变薄、视神经和视网膜表面神经胶质增生，细胞器核内染色质凝聚，核仁明显，核周间隙增宽;在术后14 d不同程度地出现光感受器内节膜盘融合，排列紊乱，内节细胞基质空化，线粒体呈凝固状;1月后，全氟菲烷聚集的下方视网膜各层均变薄并伴有细胞数量减少,视网膜萎缩、结构破坏。其中内核层和神经节细胞层出现细胞空泡化损害。内节中线粒体肿胀，嵴断裂，粗面内质网扩张增多，视细胞顶部胞质可见小空泡结构，可见髓样小体，内核层的双极细胞可见空泡结构，周围轴突内可见髓样小体，色素上皮细胞顶部可见微绒毛减少，细胞内色素颗粒增加，可见大颗粒吞噬膜盘及脂滴;3个月后,视网膜各层进一步萎缩、变薄，双极细胞及节细胞内空泡进一步增多，视细胞内见电子密度高的颗粒(为吞噬的重水小滴)，甚至出现细胞器外溢现象(见图2)。

　　A视网膜表面组和对照组对比;B视网膜下组和对照组的对比;C视网膜表面组和视网膜下组对比

　　图1 ERG检查结果(略)

　　A虫咬现象;B核周间隙增宽;C线粒体呈凝固状;D大颗粒吞噬膜盘及脂滴;E细胞器外溢

　　图2 视网膜下组的电镜结果(×20 000)(略)

　　A泡沫细胞;B微绒毛减少;C核内染色质凝聚;D膜盘数量明显减少

　　图3 视网膜表面组的电镜结果(×20 000)(略)

　　2.3.2 视网膜表面组超微结构的变化 见图3。将全氟菲烷注入兔眼内3 d后,视网膜面出现泡沫细胞(为巨噬细胞吞噬重水小滴)附着;7 d时这种病理变化进一步明显：视细胞外节的膜盘排列紊乱，内节线粒体轻微肿胀，色素上皮细胞表面有破损，顶部可见微绒毛减少，细胞内空泡增加，视网膜出现视细胞核周围间隙略增大，核型略不规则，基质略致密，细胞形态没有明显改变，排列规则，其他各层结构完整，细胞膜透明，细胞完整;14 d时，各实验组都不同程度的出现了或多或少的超显微改变，出现了视细胞外节的膜盘排列紊乱，结构不清，内节胞质内线粒体轻度肿胀，核内染色质凝聚，核仁明显，核周间隙增宽，细胞内色素颗粒增加;1个月和3个月时，超显微病理变化更加显著：色素上皮细胞顶部可见微绒毛进一步减少，细胞内色素颗粒进一步增加，视细胞外节的膜盘数量明显减少，结构不清，视细胞顶部胞质可见小空泡结构，内节中线粒体肿胀，嵴断裂，粗面内质网增加，内核层的双极细胞可见空泡结构，周围轴突内可见髓样小体，节细胞亦可见大量空泡。

　　3 讨论

　　虽然玻璃体手术时眼内注入PFCLS 后，能得到其他物质不可比拟的铺平视网膜的效果，但可对视网膜造成不同程度的损害，引起视网膜的毒性反应〔3～7〕。应用PFCLS的主要并发症是在术中PFCLS 进入视网膜下或分散成小滴,导致术后残留,产生眼内毒性。重水眼底残留造成视网膜组织学改变的机制可能如下：①视网膜下残留：视网膜下PFCLS小滴呈半球状，半透明可以随眼球运动而移动。一方面它的机械障碍作用妨碍视网膜的解剖复位，可以引起视网膜脱离复发，另一方面由于其所含杂质的毒性作用，可以引起视网膜变性，光感受器核损害，视网膜色素上皮萎缩，视网膜前膜形成〔7〕，视网膜外核层变薄，视网膜萎缩，坏死。随着时间进展，视网膜下PFCLS稳定性降低，其分解的化学产物可进一步损害视网膜，而其机械性压迫作用也是造成视网膜损害原因之一。Versura〔8〕认为视网膜下PFCLS残留2 w可以造成视网膜不可逆性损害，所以应尽早取出，如果是位于黄斑区，应立即取出。②视网膜面残留：Chang的动物实验显示，将PFCLS注入兔眼内1 w后视网膜表面出现泡沫细胞，Muller细胞变性，光感受器核减少或移到锥杆细胞层，有的出现视网膜脱离。临床报道PFCLS长期视网膜面残留，可引起视网膜表面巨噬细胞反应，视网膜前膜形成，视神经和视网膜表面神经胶质增生，视网膜外核层变薄，神经节细胞层改变，光感受器数量减少〔9〕。这些病理改变是由于PFCLS的毒性作用长期持续存在，加之其机械性压迫使视网膜缺血进一步加重，影响脉络膜血液循环，而PFCLS小滴快速移动冲击视网膜所产生的损害作用也是重要因素〔10〕。也有人认为，Muller细胞变性是PFCLS直接接触这些细胞过程中扰乱了钾的传导，这种环境的变化可以引起其他视网膜细胞的变化。

　　3.1 直接检眼镜检查 视网膜表面组全氟菲烷在玻璃体腔内4 w即有乳化和分散成为小滴(鱼卵现象)，这与临床上长期重水残留所致的乳化现象一致。视网膜表面组的视网膜未见任何明显变化。视网膜下组可见全氟菲烷注射部位局部隆起，考虑还是机械作用所致。

　　3.2 ERG检查 视网膜表面组实验眼b波的振幅和正常对照组相比在7 d后有显著性差异，表现为:b波振幅降低，但潜伏期无明显延长。视网膜下组实验眼b波的振幅和正常对照组相比在7 d后亦有显著性差异，但潜伏期无明显延长;而视网膜面下组实验眼b波的潜伏期、振幅和视网膜表面组实验眼相比无显著性差异。说明无论是视网膜下组或是视网膜表面组，在7 d后对视网膜结构及功能均产生影响。

　　3.3 透射电镜下观察 在1 d以内，不论是视网膜下组还是视网膜表面组均不会对视网膜各层细胞显微结构有损害。但在3 d以上，视网膜下组即可能会对视网膜各层细胞显微结构有损害。超过7 d，不论是视网膜下组及视网膜表面组均会对视网膜各层细胞显微结构有损害，并且视网膜下组的损害作用要大于视网膜表面组(这从视网膜明显萎缩性改变及细胞器外溢即可看出)。另外也可看出，视网膜显微结构的变化要早于ERG的变化，且随着时间的推移，不论是视网膜下组及视网膜表面组，对视网膜各层细胞显微结构的损害作用均不断加重。由此可以推断，全氟菲烷残留在1 d之内，不会对视网膜产生明显影响。但在7 d以上，不论是视网膜下组及视网膜表面组，都会对视网膜各层细胞组织结构产生损害作用。

　　到目前为止，PFCLS作为玻璃体填充物引起视网膜发生病理性改变的确切原因尚不清楚，目前的推测是:①视网膜下的重水小滴随眼球运动而移动,直接妨碍了视网膜的复位,而且它的机械性压迫及重水小滴快速移动冲击视网膜也是引起视网膜损害的重要因素。②PFCLS中可能存在的微量杂质。重水在视网膜下残留时间过长,化学稳定性降低,产生了化学产物,进一步造成对视网膜的毒性作用。笔者认为：无论是视网膜表面组还是视网膜下组，在电生理改变方面均未见明显区别，而视网膜下组的病理改变虽然要重于视网膜表面组，但差别并不明显，因此认为造成视网膜损害的原因主要还是重水的机械压迫作用，而重水的毒性作用亦不可忽视。

　　【参考文献】

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