整合素αvβ3小干扰RNA载体构建及其对人视网膜血管内皮细胞的干扰效应检测

　　作者：杨成明 张兰华 赵燕颖 吴雅臻 作者单位：吉林大学第二医院眼科，吉林 长春 130021

　　【摘要】 目的 设计和构建整合素αvβ3(integrin αvβ3)特异性的小干扰RNA表达载体,并初步验证其对靶基因的抑制作用。方法 设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamH I-Hind Ⅲ酶切线性化的pGCsilencer2.0-U6质粒上,转染重组质粒到人视网膜血管内皮细胞,通过免疫印迹 (Western印迹) 及逆转录(RT-PCR)实验检测靶基因的抑制情况。结果 成功构建pGCU6-ITGαv和pGCU6-ITGβ3 siRNAs重组质粒,转染人视网膜血管内皮细胞，Western印迹，RT-PCR 结果证实重组质粒在蛋白及mRNA水平均能抑制整合素αvβ3的表达。结论 成功构建了针对整合素αvβ3的siRNA质粒，该质粒可抑制整合素αvβ3 在人视网膜血管内皮细胞中的表达。

　　【关键词】 RNA干扰;人视网膜血管内皮细胞;整合素αvβ3;转染

　　视网膜新生血管可由多种眼病引起，如视网膜静脉阻塞，眼缺血综合症，增殖性糖尿病视网膜病变，早产儿视网膜病变等。抑制视网膜新生血管生长是治疗此类疾病的关键〔1～2〕。整合素(integrin)是一类细胞表面受体家族,由α和β两条链通过非共价键连接而成的异源二聚体跨膜糖蛋白〔3〕。这一类受体参与细胞与基质、细胞与细胞之间的黏附,在很多重要的生理过程中起重要作用。迄今为止发现23种整合素亚型，其中整合素αvβ3在正常的血管内皮细胞中表达很少，而在新生血管内皮细胞有高度表达，其中缺氧是其主要诱因之一〔4〕。αvβ3与配体结合后通过丝裂原激活的蛋白激酶途径使内皮细胞增殖，分化和迁移形成血管〔5～6〕。因此，整合素αvβ3逐渐被认为是新生血管组织的标记物。本研究拟通过RNA干涉技术建立针对整合素αvβ3的干涉质粒并观察其对人视网膜血管内皮细胞中整合素αvβ3的干涉效果，期望为人视网膜新生血管疾病的基因治疗提供实验基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 带有U6启动子及GFP的质粒pGCsilencer 2.0-U6购自上海吉凯化学公司，人视网膜新生血管细胞(HRCECs)及大肠杆菌JM109由本研究室保存，IMDM及小牛血清为Gibco产品，限制性内切酶 BamH I及Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶，Trizol及RT-PCR其他相关试剂购自Takara公司，梭华转染试剂为沈阳联星生物技术有限公司产品，整合素αvβ3 鼠抗人单克隆抗体、兔抗鼠GAPDH多克隆抗体为 Santa Cruz 产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pGCsilencer 2.0-U6/ αvβ3 siRNA重组质粒的构建及鉴定 从GenBank中整合素αv和整合素β3 mRNA 序列上寻找符合特征的靶序列,合成分别针对其编码区碱基序列的两条DNA寡核苷酸链，每条正义链包括5′ 末端BamH I酶切位点和反向的两个一致的靶序列(19 bp)，两个靶序列之间被9 bp的非同源序列( TTCAAGAGA)所间隔。3 ′末端加有TTTTTT及Hind III 酶切位点。其中整合素αv-1：5′GATCCGGAGGATTC

　　AGCATTGATTCTCAAGAGAAATCAATGCTGAATCCTCCTTTTTTGGAAA-3′;整合素αv-2：5′-AGCTTTTCCAAAAAAGGAGGATTCAGCATTGATTTCTCTTGAGAATCAATGCTGAATCCTCCG-3′。整合素β3-1：5′-GATCCGATTGGCTGGAGGAATGATTTCAAGAGAATCATTCCTCCAGCCAATCTTTTTTGGAAA-3′;整合素β3-2：5′-AGCTTTTCCAAAAAAGATTGGCTGGAGGAATGATTCTCT

　　TGAAATCATTCCTCCAGCCAATCG-3′。

　　合成的两条互补寡核苷酸链在退火缓冲液(100 mmol/L 醋酸钾30 mmol/L HEPES-KOH，2 mmol/L醋酸镁，pH 7.4)作用下退火(90 ℃ 1 min，37 ℃ 18 h)，形成双链结构。将pGCsilencer 2.0-U6分别用BamH I和Hind Ⅲ限制性内切酶消化，在T4 DNA连接酶的作用下，将两者于160℃连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌感受态，Ampicillin抗性筛选出阳性菌落，摇菌扩增,抽提质粒，质粒进行BamH I和Hind Ⅲ酶切鉴定及测序比较。

　　1.2.2 细胞培养 HRCECs 细胞用IMDM培养基，10% PBS，37℃，5% CO2培养。观察细胞生长情况，每2～3天用胰酶消化进行传代培养。

　　1.2.3 人视网膜血管内皮细胞缺氧模型的建立及分组 选用第3～6代HRCECs进行实验。待细胞长满瓶底后，用橡皮塞密封培养瓶口，插入两个中枪头作为进气及排气孔，同时将输液用滴管通过进气孔向瓶内充入5%CO2和95%N2混合气体(0.5 kg/cm2),持续30 min，使瓶内处于相对缺氧状态，再放入5%CO2孵箱中继续培养。实验共分5组：正常对照组，缺氧对照组，si-integrinαv组，si-integrinβ3组及空载体转染组。

　　1.2.4 重组质粒的转染 将模型建立后的缺氧对照组细胞再传1代。当贴壁细胞达到60%～80%融合，用无血清培养基洗3遍，具体转染方法详见梭华转染试剂盒说明，于转染后48 h收集细胞，分别用蛋白裂解液及Trizol试剂提取总蛋白及总RNA备用。

　　1.2.5 Western 印迹分析 取上述总蛋白50 μg作SDS-PAGE电泳。用电转仪将蛋白转移到PVDF膜上，封闭4℃过夜。次晨，TBST〔20 mm Tris-HCl (PH 7.4)，0.15 M NaCl，0.1%Tween〕洗3遍，5 min/遍，分别加入整合素αv和β3 鼠抗人多克隆抗体(1∶500)及GAPDH鼠抗人单克隆抗体(1∶500)室温孵育3 h，TBST洗3遍，5 min/遍，加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠多克隆二抗〔1∶2 000〕1 h，TBST洗三遍，5 min/遍，TBS(20 mM Tris-HCl(pH7.4)，0.15 M NaCl)洗1遍，5 min，用显色液(碱性磷酸酶buffer 3 ml，NBT 12 μl，BCIP 9 μl)显色，晾干拍照。

　　1.2.6 RT-PCR检测整合素αvβ3 mRNA 取上述总RNA3 μg进行逆转录，PCR扩增整合素αvβ3和内参照GAPDH。整合素αv引物序列为：正义链5′-CCAAAGCAAACACCACCCAG-3′;反义链5′-TTGAAATCTCCGACAGCCAC-3′;扩增片断长度为574 bp。整合素β3引物序列为：正义链5′ -TGACAATCATTACTCTGCCTCC-3′;反义链5′-ACGCACTTCCAGCTCTACTTT3′;扩增片断长度为250 bp。反应条件：94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，30个循环后，72℃延伸10 min。

　　1.3 统计学处理 用SPSS10.0软件，t检验判断差异。

　　2 结果

　　2.1 成功构建pGCU6-ITGαv和pGCU6-ITGβ3 siRNAs重组质粒 首先合成编码siRNA模板链DNA，与线性化pGCsilencer U6在T4连接酶作用下连接，转化感受态细胞JM109，筛选阳性质粒，小量提取，酶切鉴定，测序结果与设计序列完全一致。

　　2.2 重组质粒特异性抑制整合素 αvβ3在HRCECs细胞中的表达。

　　2.2.1 整合素 αvβ3蛋白分析 图1。Western印迹结果显示，正常对照组中整合素 αv和β3未见明显表达;而在缺氧对照组中，整合素 αv和β3表达明显增加;空载体对照组与缺氧对照组相比，表达无明显差别;si-αv组和si-β3 组与缺氧对照组相比，整合素αv和β3表达明显减少，抑制率为56.05%，有显著性差异(P<0.05)。GAPDH表达在各组中无明显差异，说明siRNA-整合素 αvβ3对整合素 αvβ3的抑制作用是特异性的。

　　1：Marker;2：缺氧对照组;3：空载体转染组;4：si-整合素αv组1：Marker;2：缺氧对照组;3：空载体转染组;4：si-整合素β3组

　　图1 HRCECs中整合素αvβ3蛋白的表达(略)

　　2.2.2 整合素 αvβ3 mRNA分析 RT-PCR结果显示，正常对照组中整合素 αv和β3未见明显表达;而在缺氧对照组中，整合素 αv和β3表达明显增加;空载体对照组与缺氧对照组相比表达无明显差别;si-整合素αv组和si-整合素β3 组与缺氧对照组相比，整合素 αv和整合素 β3表达明显减少，抑制率为60.25%，有显著性差异(P<0.05)。GAPDH表达在各组中无明显差异，说明si-整合素 αvβ3对整合素 αvβ3的抑制作用是特异性的(图2)。

　　M：Marker;1：正常对照组;2：缺氧对照组;3：空载体转染组;4：si-整合素αv组;5：si-整合素β3组

　　图2 转染HRCECs中整合素 αvβ3 mRNA 的表达情况(略)

　　3 讨论

　　视网膜新生血管形成是糖尿病性视网膜病变等缺血、缺氧性眼疾病共同的病理过程，也是老年人常见的眼底出血及视力下降的原因之一。视网膜新生血管形成是个极其复杂的过程，通常认为当视网膜缺血缺氧时，在各种生长因子及细胞因子的刺激下，已经存在的微血管网内皮细胞发生有丝分裂、迁移，以出芽的方式形成管腔。如能有效地打断这一环节,新生血管将无法形成〔6〕。

　　整合素是一类细胞表面受体家族,其中整合素αvβ3在新生血管内皮细胞有高度表达，αvβ3与配体结合后通过丝裂原激活的蛋白激酶途径使内皮细胞增殖、分化和迁移形成血管。因此，整合素αvβ3逐渐被认为是新生血管组织的标记物。已有实验证明缺氧可诱导整合素αvβ3表达的增高，而缺氧调节整合素αvβ3基因的表达是血管形成的重要调节因子。尽管众多资料显示整合素与血管生成密切相关，但其确切机制尚不清楚，可能与生长因子受体激活途径相整合，与PKC，Ras/shc/MAPK ，FAK等信号分子相互作用，调节细胞骨架和血管生成相关基因以及血管内皮细胞整合素受体的表达，影响内皮细胞和细胞外基质的相互作用，从而影响血管内皮细胞的生长或迁移〔7〕。

　　本实验应用RNA干涉技术设计构建了针对整合素αvβ3 mRNA的siRNA重组质粒，转染到已建立缺氧模型的HRCECs中，观察重组质粒对整合素αvβ3表达的影响〔8〕。RT-PCR、Western印迹等证实上述质粒可在mRNA及蛋白质水平显著抑制整合素αvβ3表达，提示由U6启动子介导的整合素αvβ3 的干涉重组质粒,能够成功的抑制整合素αvβ3在HRCEC中的表达，从而为进一步研究整合素αvβ3基因在HRCEC中的功能奠定了基础，亦为临床上治疗人视网膜新生血管等眼缺血缺氧性疾病提供了一定的实验基础和理论依据。

　　【参考文献】

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　　3 Humphries MJ.Integrin structure 〔J〕.Biochem Soc Trans，2000;28(4):311-39.

　　4 Walton HL，Corjay MH，Mohamed SN，et al.Hypoxia induces differential expression of the integrin receptors alphavbeta3 and alphavbeta5 in cultured human endothelial cells〔J〕.J Cell Biochem,2000;78(4):674-80.

　　5 Ruegg C，Domondo O，Mariotti A.Endothelial cell integrins and cox-2 mediators and therapeautic targets of tumor angiogenesis 〔J〕.Biochim Biophys Acta，2004;16(5)：51-67.

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　　7 Stromblad S，Cheresh DA.Integrins angiogenesis and vascular cell survival〔J〕.Chem Biol,2006;3(1):881-5.

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