高三尖杉酯碱对人视网膜色素上皮细胞增生影响的实验研究

作者：陈雯，胡义珍，姜发纲，曾水清   

作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院 眼科，湖北 武汉 430022　基金项目：国家自然科学基金资助项目（30772382）

【摘要】目的　 探讨高三尖杉酯碱（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ，ＨＨＴ）对人视网膜色素上皮细胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ＲＰＥ）增生的抑制及其细胞周期的影响。方法 　采用ＭＴＴ法检测５０％细胞生长抑制率时ＨＨＴ的药物浓度，并用此浓度作用于培养的人视网膜色素上皮细胞，用免疫细胞化学染色分析观察ＲＰＥ细胞的Ｋｉ－６７表达，流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 　ＨＨＴ抑制培养的人色素上皮细胞的增生与药物剂量成正比，５０％细胞生长抑制率时ＨＨＴ的药物浓度约为４.７７ ｍｇ／Ｌ，Ｋｉ－６７阳性细胞率在对照组和ＨＨＴ组分别为８９.１％和３３.８％（Ｐ＜０.０１），两组中阳性细胞核积分光密度值分别为６０.７±５.７和２９.６±７.８（Ｐ＜０.０１）。流式细胞仪检测细胞周期变化示ＨＨＴ组Ｇ１期细胞比例由７２.１４％增至８３.９５％，Ｇ２?鄄Ｍ期细胞比例由１５.４６％下降至３.１８％。结论　 ＨＨＴ可抑制ＲＰＥ细胞的增生。ＨＨＴ作用后ＲＰＥ细胞中Ｇ０?鄄Ｇ１期细胞增多，Ｇ２?鄄Ｍ期细胞明显减少，ＨＨＴ对Ｇ２?鄄Ｍ期细胞有杀伤作用。ＨＨＴ有望成为防治视网膜脱离复位术后发生增生性玻璃体视网膜病变（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ，ＰＶＲ）的一种新药。 【关键词】  色素上皮　视网膜　细胞　培养　增生　高三尖杉酯碱　流式细胞术　增生性玻璃体视网膜病变（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ，ＰＶＲ）是视网膜脱离复位术失败的主要原因，主要与视网膜色素上皮细胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ, ＲＰＥ）的病理性增生有关。控制ＲＰＥ细胞的增生，促使ＲＰＥ细胞的凋亡，是防治ＰＶＲ的一种途经［１，２］。目前常用的玻璃体手术治疗难以防止术后再增生，应用的抗代谢药物（道诺霉素［３］、丝裂霉素Ｃ［４］、５－氟尿嘧啶［５］）因具有较强的毒副作用及不肯定的疗效而受到限制，寻找一种安全有效的药物是临床医生追求的目标。高三尖杉酯碱（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ，ＨＨＴ）是我国所特有的一种中药，是从三尖杉植物——海南粗榧中提取的四种活性成分之一。本实验通过研究ＨＨＴ对人ＲＰＥ细胞增生及细胞周期的影响，探讨ＨＨＴ药物的作用机制，为ＨＨＴ应用于临床提供理论依据。

    １  材料和方法

    １.１  主要试剂  Ｄｅｌｂｅｃｃｏ改良的Ｅａｇｌｅ培养基（Ｄｅｌｂｅｃｃｏｎ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）干粉（Ｇｉｂｃｏ产品），胰蛋白酶（Ｄｉｆｃｏ产品），胎牛血清（Ｇｉｂｃｏ产品），高三尖杉酯碱（ＨＨＴ），鼠抗人细胞角蛋白（Ａｎｔｉ－Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ Ｐａｎ）单克隆抗体，鼠抗人Ｋｉ-６７单克隆抗体和链霉亲合素－生物素化过氧化物酶复合物（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｂｉｏｔｉｎ－ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＳＡＢＣ）试剂盒（Ｂｏｓｔｅｒ产品）和ＤＮＡ染色试剂盒（Ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＮＡ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ）（Ｃｏｕｌｔｅｒ产品）。

    １.２  方法

    １.２.１  人ＲＰＥ细胞的培养及鉴定  人ＲＰＥ细胞取自２０～３５岁意外死亡１２ ｈ内人的眼球，人ＲＰＥ细胞的分离、培养方法参见文献［６］，选第３～第６代细胞用于实验。细胞鉴定采用Ｂｏｓｔｅｒ公司试剂盒作角蛋白免疫组化检测：鼠抗人细胞角蛋白（Ａｎｔｉ－Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ Ｐａｎ）单克隆抗体作第一抗体，对照组用ＰＢＳ替代第一抗体，以ＳＡＢＣ法行免疫细胞化学染色。

１.２.２  ＭＴＴ实验检测人ＲＰＥ细胞增生  取第３代ＲＰＥ细胞接种于９６孔板中，密度为１×１０５细胞／ｍｌ，每孔１００ ?滋ｌ，加入含１００ Ｕ／ｍｌ青霉素，１００ ｇ／ｍｌ链霉素，２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液培养２４ ｈ后将培养液换成含０.００１、０.０１、０.１、１、１０、２０、３０ ｍｇ／Ｌ七种浓度ＨＨＴ的２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ液１００ ?滋ｌ，对照组为不含ＨＨＴ的等体积培养液，每个浓度设５个复孔，另设空白对照组。培养１２ ｈ后，更换成不含ＨＨＴ的培养液继续培养２４ ｈ，然后每孔加入５ ｇ／Ｌ ＭＴＴ ２０ ?滋ｌ，继续培养４ ｈ后，弃上清液，加入二甲亚矾１５０ ?滋ｌ，振摇１５ ｍｉｎ后，于酶标仪５５０ ｎｍ波长下测ＯＤ值，并以下列公式计算：细胞抑制率＝（空白对照组平均ＯＤ值－处理组平均ＯＤ值）／空白对照组平均ＯＤ值×１００％。ＨＨＴ５０％抑制浓度（ＩＣ５０）通过将药物浓度取常用对数后作自变量，细胞增殖抑制率作因变量，然后求出直线回归方程而得出。

    １.２.３  ＨＨＴ对人ＲＰＥ细胞Ｋｉ－６７表达的影响  将细胞接种于含玻片的１２孔板中培养２４ ｈ，换成含ＨＨＴ ５ ｍｇ／Ｌ的２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ液培养，同时设不加药组作正常对照，培养１２ ｈ后撤药，加入２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ液继续培养２４ ｈ，取出长有细胞的玻片固定，用鼠抗人细胞Ｋｉ－６７单克隆抗体作第一抗体，染色时设阴性对照组用ＰＢＳ替代第一抗体，ＳＡＢＣ法行免疫细胞化学染色。显微镜（×４００）下计数５个视野中阳性细胞数，计算阳性细胞数占细胞总数的比率。实验组与对照组每组选３张细胞标本，每张选取４８～５５个非边缘区的阳性细胞，采用ＭＰＩＡＳ－５００真彩色医学图像分析系统测定免疫组化片阳性细胞核的积分光密度（ＯＤ）。

    １.２.４  流式细胞仪分析人ＲＰＥ细胞周期  细胞以５×１０４细胞／ｍｌ密度接种，２４ ｈ后换成含ＨＴＴ（５ ｍｇ／Ｌ和５０ ｍｇ／Ｌ）的培养液培养同时设对照组，培养１２ ｈ后撤药，加入２０％牛血清的ＤＭＥＭ液继续培养２４ ｈ，消化收集细胞，用ＰＢＳ制成单细胞液，放－２０℃ 和７５％冰乙醇中固定，调整细胞密度为１×１０６／ｍｌ，取１００ ?滋ｌ样品加入等体积ＤＮＡ染液，室温放置２０ ｍｉｎ，流式细胞仪以４８８ ｎｍ激发光测定，每种浓度重复３次。

    １.２.５  统计学方法  数据采用ＳＰＳＳ １０.０软件包处理，将药物浓度取常用对数后作自变量，细胞增殖抑制率作因变量，求出直线回归方程。实验组和对照组人ＲＰＥ细胞的Ｋｉ－６７表达率采用?字２检验，Ｋｉ－６７表达阳性细胞核的积分光密度采用ｕ检验，流式细胞仪分析人ＲＰＥ细胞周期采用ｔ检验。

    ２  结果

    ２.１  细胞培养及鉴定  原代培养的细胞多呈多边形或扁形，胞浆内富含棕褐色颗粒，３～４周铺满。细胞传代２～３次后色素颗粒逐渐减少，消失，细胞呈梭形。阳性细胞角蛋白染色细胞染成棕黄色，呈纵横交错的网状结构。

    ２.２  ＨＨＴ对体外培养的人ＲＰＥ细胞的抑制能力与浓度的对数值呈线性关系。回归方程为Ｙ＝０.４２６＋０.１０９ ＬｏｇＸ，Ｙ为ＨＨＴ对体外培养的人ＲＰＥ细胞的抑制能力，Ｘ为ＨＨＴ浓度，ＩＣ５０时ＨＨＴ的浓度为４.７７ ｍｇ／Ｌ（见图１），回归系数经ｔ检验得，ｔ＝９.１９４，Ｐ＜０.０１。

    ２.３  ＨＨＴ影响人ＲＰＥ细胞的Ｋｉ－６７表达  阴性对照片隐约可见细胞核边界，细胞核未染色，细胞浆淡染（见图２）。正常对照组多数细胞呈阳性反应，即细胞核染为棕黄色，边界清楚，细胞核仁呈棕黑色，细胞浆色淡（见图３）。ＨＨＴ实验组细胞核染色明显变浅，细胞浆颜色变化不大（见图４）。显微镜下实验组计数的１４８个细胞中，阳性细胞占３３.８％，对照组显微镜下计数的１１０个细胞中，阳性细胞占８９.１％，两组间阳性细胞率差异有非常显著性（?字２＝７８.９２，Ｐ＜０.０１）。实验组与对照组分别检测阳性细胞数１４９和１５６个，阳性细胞细胞核积分光密度值分别为２９.６±７.８和 ６０.７±５.７，两组差异有非常显著性（ｕ＝３９.６１，Ｐ＜０.０１）。

２.４  流式细胞仪分析人ＲＰＥ细胞周期  ＨＨＴ作用后人ＲＰＥ细胞中Ｇ０－Ｇ１期细胞增多，与对照组比较差异有显著性（Ｐ＜０.０５）；Ｇ２－Ｍ期细胞明显减少，与对照组比较差异有非常显著性（Ｐ＜０.０１）（见表１）。

    ３  讨论

    高三尖杉酯碱（ＨＨＴ）是自三尖杉属植物中分离出来的生物碱，是我国所特有的一种中药，主要被用于治疗白血病，其治疗白血病的机制为对Ｓ期细胞杀伤较明显，可直接对核酸的结构与代谢发生作用，也可抑制蛋白质合成而干扰ＤＮＡ合成，导致细胞发生死亡。近来还有报道称ＨＨＴ可通过下调端粒酶活性而诱导白血病ＨＬ－６０细胞的凋亡［７~９］。过去我们在防治外伤性ＰＶＲ的实验研究中报道过，体外ＨＨＴ可显著抑制成纤维细胞增殖，它对结膜成纤维细胞产生５０％抑制效应的浓度为０.００５ ｍｇ／Ｌ，并且ＨＨＴ玻璃体注射不会导致正常眼组织的毒性损害［１０］。目前研究认为ＰＶＲ主要与ＲＰＥ细胞的病理性增生有关，因此控制ＲＰＥ细胞的增生，促使ＲＰＥ细胞的凋亡，是防治ＰＶＲ的一种途经［２，３］。本实验通过研究ＨＨＴ对ＲＰＥ的影响，为ＨＨＴ应用于临床防治ＰＶＲ提供理论依据。本次研究发现，ＨＨＴ可明显抑制ＲＰＥ的增生，它对ＲＰＥ细胞的生长抑制率与其浓度的对数成正比，它对ＲＰＥ细胞产生５０％抑制效应的浓度约为４.７７ ｍｇ／Ｌ，约为对成纤维细胞产生５０％抑制效应的浓度的一千倍，原因可能为ＲＰＥ细胞的增生能力较成纤维细胞弱。从ＨＨＴ对ＲＰＥ细胞表达Ｋｉ－６７的影响也可以看出ＨＨＴ可明显抑制人ＲＰＥ细胞的增生。从细胞生长周期看，ＨＨＴ对ＲＰＥ细胞的细胞周期影响一方面是使ＲＰＥ细胞集中在Ｇ１期，可能的机制是通过在Ｇ１期控制某种蛋白的合成而阻止ＲＰＥ细胞从Ｇ１期进入Ｓ期，从而使ＲＰＥ细胞周期延长，另一方面ＨＨＴ又使Ｇ２－Ｍ期细胞明显减少，可能的机制是ＨＨＴ对Ｇ２期细胞有杀伤作用，从而减少ＲＰＥ细胞进入分裂期，这两方面的共同作用达到了抑制ＲＰＥ细胞增生的目的。总之，ＨＨＴ是通过影响Ｇ１期和Ｇ２期来共同抑制ＲＰＥ细胞的增生。我们的下一步研究包括：ＨＨＴ可否诱导ＲＰＥ细胞的凋亡，ＨＨＴ在玻璃体内药代动力学研究以及使用治疗浓度时药物的安全性。