先天性核性白内障晶状体蛋白质双向凝胶电泳可重复性与分辨率研究

　　作者：郁梅, 朱思泉 作者单位：1新疆医科大学第一附属医院眼科，新疆乌鲁木齐830011; 2首都医科大学附属北京同仁医学眼科中心, 北京100730

　　【摘要】 目的:　研究人先天性核性白内障混浊晶状体蛋白质双向凝胶电泳(2DE)的可重复性及分辨率。 方法:　临床手术中抽提先天性核性白内障患儿混浊晶状体组织蛋白，采用固相pH 梯度等电聚焦( IPGDALT) 的方法, 选用12.5%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,分别以270 μl、300 μl上样量对晶状体组织总蛋白(crystallin)进行分离,并用银染显示分离效果。结果:　上样量为270 μl、12.5%的分离胶对晶状体总蛋白的分离效果较好,上样量为300 μl、12.5%的分离胶对高相对分子质量蛋白的分离效果较好。凝胶点的匹配率为93.17%。　结论:　采取适当的制备方法及合适的上样量可以充分分离人混浊晶状体蛋白质，并可以得到较好的分辨效果，但重复性还有待于进一步提高。

　　【关键词】 晶状体; 蛋白质; 双向凝胶电泳

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(30471864)

　　Research on repeatability and resolution of congenital nuclear cataract lens protein twodimensional electrophoresis

　　YU Mei, ZHU Siquan

　　(Department of Ophthalmology, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)Abstract： Objective: 　To study the repeatability and resolution of congenital nuclear cataract cloudy lens protein twodimensional electrophoresis (2DE). Methods:　Lens proteins form 6 years old congenital nuclear cataract child were separated using 2DE using series SDSPAGE density (12.5%) and silver staining methods. Results: Crystallin could be well separated from 270 μl of total protein sample using 12.5% SDSPAGE. High molecular weight proteins could be well separated from 300 μl sample using 12.5% SDSPAGE. The matching rate was 93.17%. Conclusion: Using IPGDALT method, electrophoresis provide better analysis for the lens protein separation, but the data repeatability should be further improved.

　　Key words: 　lens; protein; twodimensional electrophoresis

　　近年来,蛋白质组的概念及技术已被引用到晶状体的蛋白质研究中[1，2 ] 。晶状体是一富含蛋白质的组织，应用蛋白质组方法研究各种生理或病理状态下晶状体蛋白质的组成，并揭示这一群体的表达特征，有极其重要的现实意义。双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的支撑技术，是目前常用的唯一一种能够在一块胶上分离数千种蛋白质的方法,广泛应用于生物学的各个领域。本研究对核性先天性白内障混浊晶状体蛋白质双向凝胶电泳的可重复性及分辨率进行研究,为进一步人晶状体疾病的比较蛋白质组研究奠定基础,现报道如下。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　来源晶状体组织取自6岁先天性核性白内障患儿,男性2例3眼，女性3例3眼。

　　1.2取材方法

　　在环形撕囊后，水化分离前，用特制的钝性针头吸取晶状体组织蛋白质，控制抽提直径6 mm大小的前2/3的晶体组织，置于-80℃低温保存。

　　1.3试剂与设备

　　固相pH梯度干胶条(IPGs，immobiline pH gradient DryStrip)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、三羟甲基胺基甲烷(Tris)、溴酚蓝，过硫酸胺(APS)、甘氨酸(Glycine)、丙烯酰胺、IPGBuffer、覆盖液(Drystrip Cover fluid)、琼脂糖、尿素、标准蛋白标志物购自APharmacia公司;三氟乙酸(TFA)、N′甲叉双丙烯酰胺、考马斯亮蓝R250、CHAPS购自Sigma公司;乙睛为Fisher色谱纯，无水醋酸钠、无水碳酸钠、硝酸银、硫代硫酸钠、戊二醛、乙醇、冰醋酸、甲醇、乙腈、甘油、甲醛等均为国产分析纯或色谱纯。设备主要有IPGphor等点聚焦电泳仪，图像扫描仪购自瑞典Amersham pharmacia Biotech公司;PROTEAN II Xi Cell垂直电泳仪，CentriVap Centrifugal Concentrators and Cold Traps真空离心浓缩仪购自LABCONCO公司;Image Master 2D Elite 软件包，图像扫描仪。

　　1.4实验方法

　　1.4.1溶液的配置

　　(1)裂解液:2 mol/L硫脲，7 mol/L尿素，4%CHAPS，1%DTT，2%两性电解质。(2)重泡涨液:8 mol/L尿素，2%CHAPS，0.5%IPG缓冲液，0.4%DTT。(3)平衡液:50 mmol/L TrisHCL缓冲液(pH值为8.8)，6 mol/L尿素，30%甘油，2%SDS及溴酚蓝。

　　1.4.2组织蛋白提取

　　将晶状体组织于4℃用样本裂解液(8 mol/L尿素，40 g/L CHAPS,20 g/L Pharmalyte3～10)裂解3 h,并反复液氮冻融离心，10 000 r/min,每次离心约10 min,组织基本溶解后取其上清即为样本液。用Bradford法测定样品蛋白质质量浓度,裂解液做为空白对照,并据此确定质谱的上样量。

　　1.5双向凝胶电泳

　　(1)第一向等电聚焦电泳: 主要参考IPGphor等电聚焦系统指南和Gorg等[3]采用的方法进行。(2)平衡:等电聚焦结束后,迅速取出IPG胶条于10 ml平衡液Ⅰ (50 mmol/L TrisHCl, 6 mol/L尿素，30%甘油，2% SDS，1%DTT和痕量溴酚蓝)中平衡15 min,再置于10 ml平衡液Ⅱ (2.5%碘乙酰胺取代1%DTT)中平衡15 min。(3)第二向垂直SDSPAGE电泳:将平衡后的IPG胶条移至12.5% SDSPAGE连续胶上端, 1%琼脂糖封固。20℃循环水恒温,先以15 mA /每块胶进样,再以30 mA /每块胶恒流电泳直至溴酚蓝到达距胶底边0.5～1 cm处停止电泳。凝胶固定后银染。

　　1.6凝胶图像分析

　　利用ImageScanner 光学扫描仪扫描获取图像,在Pentium Ⅱ微处理器(Dell,128 MB 内存) 下运行, 分析蛋白图谱。用ImageMaster 2D Elite 3.01来进行凝胶点的检测(Spotdetection)、背景消减(Background substraction)、相对分子质量和等电点校正、归一化处理(Volume normalization)和凝胶匹配分析(Gel mach)。

　　2结果

　　2.1不同上样量12.5%凝胶所得混浊晶状体蛋白凝胶图像样品浓度为3.359 μmol/L, 上样量为300 μl、12.5 %的分离胶对高相对分子质量蛋白的分离效果较好 (图1a);上样量为270 μl、12.5 %的分离胶对混浊晶状体总蛋白的分离效果较好 (图1b) 。

　　2.2双向凝胶电泳的分辨率和重复性

　　每个标本按相同实验条件进行3次重复实验。大部分晶状体蛋白质分布在Mr 14 400～66 000、等电点(PI)5～9的范围内，高丰度蛋白质斑点分布在Mr 20 100～45 000、等电点(PI)6～8的区域内。在上样量相同的情况下(270 μl),银染检出点数:505个,银染的灵敏度高。在重复性实验中,选用270 μl的上样量,银染,进行重复性实验。利用ImageMaster 2D Elite 软件进行分析,选其中的B胶做参考胶,图2a与图2b的匹配率为93.17%,凝胶的蛋白量的相关系数为0.745 (P<0.01) 。

　　3讨论

　　双向凝胶电泳是目前最好的蛋白质分离方法[4]。所得蛋白双维排列图中每个点代表样本中一个或数个蛋白质，并且蛋白质的等电点、分子量和在样本中的含量也可显现出来[3]。理论上晶状体蛋白及其修饰都可以通过双向凝胶电泳得到充分分离[5,6]。以往的晶状体蛋白质组学研究多在动物晶状体上,2002年Lampi和Ueda的研究均提供了鼠透明晶状体蛋白组的二维电泳图谱[1,2]。国内对兔正常晶状体蛋白质进行电泳图像分析并检测出180个蛋白质斑点,质谱鉴定分析出16个高丰度晶状体蛋白质[7]。本研究应用蛋白质组学的双向凝胶电泳技术,初步建立了人混浊晶状体组织的双向电泳图谱,结果显示高丰度蛋白斑点重复性尚可,而其他的低丰度蛋白的重复性尚待提高。且实验中使用同次实验的两块胶,在实验条件相同的情况下匹配率高，提示在蛋白质差异比较实验中, 应对一批样品同时进行电泳,可提高实验的精度。本实验取材来自临床手术中定量抽取的晶状体组织,不影响正常的手术效果及患者的预后。晶状体组织经过双向凝胶电泳分离，可以观察到500 多个蛋白多肽斑点,各斑点清晰、重复性良好。晶状体蛋白有其自身的特点, 即晶状体蛋白含量异常丰富,在双向凝胶电泳时,上样量受到限制,很难使一些低丰度蛋白和晶状体蛋白同时显现,而这些蛋白往往是重要的调控蛋白。本实验在双向凝胶电泳时,综合小样本量和低密度凝胶电泳与大样本量高密度凝胶电泳结果,可以更好地分析晶状体蛋白的分离效果,但重复性还有待进一步提高。由于双向凝胶电泳对于相对分子质量大于100 000的蛋白及某些水不溶性蛋白的分离存在局限性,可结合单向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，可极大地提高晶状体蛋白质组研究的分辨率。

　　【参考文献】

　　[1]Lampi KJ, Sbib M, Ueda Y, et al. Lens proteomics : analysis of rat crystalline sequences and twodimensional eletrophoresis map[J] . Invest Ophthalmol Vis Sic,2002,43:217223.

　　[2]Ueda Y, Duncan MK, David LL,et al. Lens proteomics : The accumulation of crystalline modifications in the mouse lens with age[J] . Invest Ophthalmol Vis Sic,2002,43:205215.

　　[3]Gorg A, Obermaier C, Boguth G, et al. The current state of twodimensional electrophoresis with immobilized pH gradients[J]. Electrophoresis, 2000,21(6):10371053..

　　[4]Alison A. A postgenomic challenge: learning to read patterns of protein synthesis[J]. Nature, 1999,402(6763):715720.

　　[5]Ueda Y, Duncan MK, David LL, et al. Lens proteomics: the accumulation of crystallin modifications in the mouse lens with age[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2002,43(1):205215.

　　[6]Matsushima H, Mukai K, Obara Y， et al. Changes in cytoskeletal proteins in childhood cataract lenses[J]. Jpn J Ophthalmol,2000,44(2):187188.

　　[7]刘奕志,张敏,柳夏林,等.兔晶状体蛋白质组的双向电泳和质谱鉴定研究[J].中华眼科杂志,2004,40(2):113117.