TLR4和CD14在体外培养的晶状体上皮细胞有表达

　　作者：黄秀榕，祁明信，王军 作者单位：(350003)中国福建省福州市，福建中医药大学病理生理研究中心;(350003)中国福建省福州市，福建中医药大学附属第二人民医院眼科

　　【摘要】目的：探讨Toll样受体4(tolllike receptor 4，TLR4)和CD14在晶状体上皮细胞(lens epithelial cell, LEC)的表达。方法：采用一步法反转录多聚酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测LEC中TLR4 mRNA和CD14 mRNA的表达。结果：用RTPCR检测分别获得451bp和348bp的清晰扩增条带，经基因测序证实为TLR4 mRNA和CD14 mRNA。结论：晶状体上皮细胞可表达TLR4和CD14。

　　【关键词】 Toll样受体4;CD14;表达;晶状体上皮细胞

　　Expression of TLR4 and CD14 in lens epithelial cell in vitro

　　XiuRong Huang, MingXin Qi, Jun Wang

　　Foundation item: Fujian Key Project of Chinese Medicine, China (No.Wzzb0602)

　　Research Centre of Pathophysiology, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China;2Department of Ophthalmology, the Second Affiliated Hospital, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China

　　Abstract　AIM：To study the expressions of tolllike receptor 4(TLR4)and CD14 in lens epithelial cell(LEC).METHODS：The expressions of TLR4mRNA and CD14mRNA were detected by onestep polymerase chain reaction (PCR) with reverse transcription (RTPCR) in cultured LEC.RESULTS： The amplified clear bands of 451bp and 348bp were obtained respectively via RTPCR, which were confirmed to be TLR4mRNA and CD14mRNA by means of gene sequence analysis.CONCLUSION: There are expressions of TLR4 and CD14 in LEC.

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　　KEYWORDS: Tolllike receptor 4; CD14; expression; lens epithelial cell

　　0　引言

　　Toll样受体(tolllike receptor，TLR)对机体免疫特别是感染性免疫具有十分重要的意义。迄今在人细胞膜上已发现11种TLR(TLR1 TLR11)，其中TLR4是研究最多的一种Toll样受体蛋白。有关TLR4的研究被《Science Watch》杂志列为2001年十大生物科学重要进展之一[1]。TLR4能识别G外膜的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，并介导LPS引起的炎症反应。LPS激活TLR4的信号途径需要CD14的参与，CD14能促进TLR4对LPS的应答。已有研究表明，TLR4在许多细胞均有表达[2]。但至今尚不知在晶状体上皮细胞(lens epithelial cell, LEC)是否表达TLR4，也不知LEC是否表达CD14。白内障是当今世界的主要致盲性眼病，超声乳化白内障囊外摘除联合人工晶状体植入手术是目前的主要复明手段。但研究表明术后眼内发生了炎症反应[35]。白内障术中及术后炎症介质释放、补体激活、血房水屏障破坏等均刺激LEC的增殖并向后囊膜移行，促使后囊膜混浊(posterior capsular opacification, PCO)的发生，因此炎症反应在促进后发性白内障(after cataract)的形成中起重要作用[6]。我们采用RTPCR法检测体外培养的LEC的TLR4mRNA和CD14mRNA表达，为探讨TLR4在白内障术后炎症反应和后发性白内障发病中的作用提供科学依据。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　Trizol系MBI公司产品。一步法RTPCR试剂盒系日本TaKaRa公司产品。琼脂糖系西班牙Condas进口分装试剂。溴化乙锭、Tris碱、溴酚兰、蔗糖、甲醛、RNA Sample Loading Buffer(编号L003001)均购自上海博亚公司。100bp DNA Marker，EDTA Na2购自北京天为时代科技有限公司。胰蛋白酶、硼酸和焦碳酸二乙酯(DEPC)系美国Amresco公司产品。DMEM培养基干粉系美国Gibco公司产品。乙二胺四乙酸(EDTA)系美国Augus公司产品。引物由Invitrogen上海英骏生物技术公司合成。蛋白核酸测定仪(德国Eppendorf AG 22331 Humburg)、PCR扩增仪(德国Eppendorf 5331型)、电泳仪、凝胶成像分析系统(美国BioRad)。取健康新鲜小牛眼的晶状体前囊膜，用胰蛋白酶消化后加入DMEM培养液，放入37℃，5% CO2培养箱中培养。用倒置显微镜观察原代LEC生长情况。经7～10d细胞基本融合后进行细胞传代。取第3代细胞用于以下实验。

　　1.2　方法

　　收集LEC细胞，用Trizol试剂提取总RNA并鉴定，分别取TLR4和CD14样品总RNA 0.5mg，总反应体积为25μL，用TaKaRa公司一步法RTPCR试剂盒反转录为cDNA。以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照进行PCR扩增。上下游引物由Invitrogen上海英骏生物技术公司合成。GAPDH上游引物，5ATCGTCGCCATCAATGACCC3，下游引物，5ATACTCAGCACCAGCATCACC3，扩增产物为220bp。TLR4上游引物，5ACCACCTCTCCACCTTGATAC3，下游引物，5CCAGCCAG ACCTTGAATACAG3，扩增产物为451bp。CD14上游引物，5CCGAAGCCTGACTGGTCTAG3，下游引物，5ACCTCCTGTTGTCCACGATAC3，扩增产物为348bp。TLR4和CD14的反应条件：50℃预变性30min, 94℃ 2min;PCR扩增94℃ 45s，53℃(57℃为CD14的退火温度)30s，72℃ 1min，共28次循环;最后72℃延伸3min。PCR产物以15g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统做条带灰度扫描并拍照，将扩增结果与GeneBank的基因序列比较。

　　2　结果

　　采用Trizol一步法提取LEC总RNA，A260/A280均介于1.8～2.0 之间，表明RNA纯度高。凝胶电泳结果(图1)，可见28S和18S条带边缘清晰，无拖尾，28S比18S约为2∶1，表明RNA样品结构完整、无降解，可进行RTPCR扩增。以LEC总RNA为模板，用一步法RTPCR技术，分别扩增TLR4和CD14，经15g/L琼脂糖凝胶电泳(图2，3)显示分别获得451bp和348bp的清晰扩增条带，与预计扩增片断的大小相符。PCR扩增完毕后，将TLR4和CD14分别于15g/L的琼脂糖凝胶进行电泳，回收、纯化后，ABIPRISM377自动测序仪进行RTPCR产物核苷酸序列测定，结果与GeneBank中的基因序列一致，证明为TLR4和CD14。

　　3　讨论

　　TLR4在眼内多种组织中也有分布。2001年Song等[7]研究发现HCEC能表达TLR4mRNA，且当LPS与HCEC共同孵育后能引起TLR4mRNA表达上调。他同时还发现人角膜基质细胞和角膜内皮细胞也能表达TLR4mRNA和CD14mRNA[8]。2004年Ueta等[9]报道HCEC能表达TLR2mRNA和TLR4mRNA及其相应蛋白。2004年Brito等[10]报道人睫状体不含色素的上皮细胞能高表达内毒素受体蛋白TLR4和CD14。2004年Kumar等[8]报道人视网膜色素上皮细胞能表达TLR1至TLR7，TLR9，TLR10的mRNA，其中TLR1mRNA和TLR3mRNA的含量最丰富。Chang等[11]采用RTPCR和免疫组化方法检测发现正常人眼葡萄膜、视网膜、巩膜和结膜均能表达TLR4和CD14的mRNA。经广泛查阅国内外文献，均未见TLR4能否在LEC表达的报道。我们利用一步法RTPCR检测，首次发现体外培养的牛晶状体上皮细胞能表达TLR4mRNA和CD14 mRNA。

　　曾有研究报道白内障手术人工晶状体植入术后发生前房渗出、房水中IL2和TNF增多、嗜中性白细胞和单核/巨噬细胞增多，说明人工晶状体植入术后眼内发生了炎症反应[35]。术中及术后血房水屏障破坏、炎症介质释放、补体激活等炎症反应，使手术残留的LEC发生增殖，并向后囊膜移行、纤维化而导致后囊膜混浊，使白内障患者手术后视力再度下降，发生后发性白内障。已有报道TLR4能识别LPS，并介导LPS引起的炎症反应。且LPS激活TLR4的信号途径需要CD14参与，CD14能促进TLR4对LPS的应答，表明TLR4与CD14间存在着相互作用。我们发现晶状体上皮细胞表达TLR4和CD14，提示TLR4和CD14可能在白内障术后引起的眼内炎症反应和后发性白内障的发生发展中起重要的作用。

　　【参考文献】

　　1　Krutzik SR, Sieling PA, Modlin RL. The role of Tolllike receptors in host defense against microbial infection. Curr Opin Immunol 2001;13:104108

　　2　王军，黄秀榕，祁明信. Toll样受体在眼部各组织中的表达及其作用. 眼科研究 2006;24(2):222224

　　3　黄秀榕，祁明信，沈世仁，等. 一氧化氮在人工晶状体植入术后眼内炎症反应中的作用.中国病理生理杂志2000;16(3):258261

　　4　黄秀榕，祁明信，沈世仁，等. 人工晶状体植入术后房水白介素2和肿瘤坏死因子α水平及其与一氧化氮的关系. 中国病理生理杂志 2001;17(12):11961198

　　5　祁明信，黄秀榕，沈世仁，等. 兔晶状体摘除和人工晶状体植入术后房水细胞因子水平和一氧化氮含量与眼内炎性反应的关系. 中华眼科杂志 2003;39(1):4143

　　6　Odrich MG, Hall SJ, Worgul BV, et al. Posterior capsule opacification: experimental analyses. Ophthalmic Res 1985;17(2):7584

　　7　Song PI, Abraham TA, Park Y, et al. The expression of functional LPS receptor proteins CD14 and tolllike receptor 4 in human corneal cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;42(12):28672877

　　8　Kumar MV, Nagineni CN, Chin MS, et al. Innate immunity in the retina: Tolllike receptor (TLR) signaling in human retinal pigment epithelial cells. J Neuroimmunol 2004;153(12):715

　　9　Ueta M, Nochi T, Jang MH, et al. Intracellularly expressed TLR2s and TLR4s contribution to an immunosilent environment at the ocular mucosal epithelium. J Immunol 2004;173(5):33373347

　　10　Brito BE, Zamora DO, Bonnah RA, et al. Tolllike receptor 4 and CD14 expression in human ciliary body and TLR4 in human iris endothelial cells. Exp Eye Res 2004;79(2):203208

　　11　Chang JH, McCluskey P, Wakefield D. Expression of tolllike receptor 4 and its associated lipopolysaccharide receptor complex by resident antigenpresenting cells in the human uvea. Invest Ophthalmol Vis Sci 2004;45(6):18711878