AQP1和VEGF在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的表达

　　作者：张金红，张文芳，鲁建华，张书，梁丽 作者单位：(730030)中国甘肃省兰州市，兰州大学第二医院眼科

　　【摘要】目的：研究大鼠视网膜缺血再灌注损伤后水通道蛋白1和血管内皮生长因子的表达情况并探讨二者在视网膜缺血再灌注损伤中表达的意义。方法：通过提高眼内压的方法建立大鼠视网膜缺血再灌注模型，于术后6，12，24，48h;3，7d用免疫组化的方法检测水通道蛋白1和血管内皮生长因子在大鼠视网膜的表达情况，并以正常大鼠视网膜作为对照。结果：正常对照组大鼠视网膜未能检测到血管内皮生长因子的阳性表达，缺血再灌注12h后开始出现表达，48h达高峰，且差异具有统计学意义(P<0.01)。水通道蛋白1在正常对照组可见到阳性表达，缺血再灌注组随时间增长表达不断增强，7d在外层视网膜也出现表达，差异有统计学意义(P<0.01)。结论：水通道蛋白1和血管内皮生长因子在视网膜缺血性疾病中起着重要的作用，二者可能共同影响了视网膜的水代谢过程。

　　【关键词】 水通道蛋白1;血管内皮生长因子;缺血再灌注;大鼠

　　Expression levels of AQP1 and VEGF in rat retinal ischemia reperfusion injury

　　JinHong Zhang,WenFang Zhang,JianHua Lu, Shu Zhang, Li Liang

　　Department of Ophthalmology, Affiliated Second Hospital, Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China

　　Abstract　AIM:To investigate the expression levels and significance of aquaporin1 (AQP1) and vascular endothelial growth factor(VEGF) in the retinal ischemia reperfusion injury(RIRI). METHODS:The model of transient RIRI of the rat retina was constructed by elevation of the intraocular pressure .The expression levels of AQP1 and VEGF was measured 6, 12, 24 and 48 hours, 3, 7 days after retinal ischemia using immunohistochemical staining. Normal retina was treated as control group. RESULTS: VEGF positive cells were not found in normal group and began to express after 12 hours in ischemia group, increased gradually and reached maximal levels 48 hours after RIRI. There was statistical difference between 48 hours group and other ischemia reperfusion group (P<0.01). AQP1 positive cells were found in the outer retina in normal group, increased gradually in ischemia reperfusion group and also were found in the inner retina 7 days after RIRI, and the difference was significant (P<0.01). CONCLUSION: AQP1 and VEGF may play an important role in various blinding ischemic ocular diseases, and coeffect the water metabolism of retina.

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　　KEYWORDS: AQP1; VEGF; ischemia reperfusion; rat

　　0　引言

　　视网膜血管性疾病包括视网膜中央动脉/分支动脉阻塞，静脉阻塞，早产儿视网膜病变，糖尿病性视网膜病变等，以及临床常见的闭角型青光眼急性发作和一些影响视网膜血流的内眼手术，这些疾病和手术均存在着不同程度的视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia reperfusion injury，RIRI)，其造成视网膜的水肿是影响患者视力恢复的主要因素之一。水通道蛋白1(aquaporin1，AQP1)作为一种调节水分子跨膜转运的膜蛋白，维持体内水的渗透平衡[1]。其异常表达，打破了视网膜组织对水的调解平衡，并在缺血缺氧的过程中诱导新生血管的生成，导致了视网膜的水肿[2,3]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在体内可促进新生血管的形成，同时也可以引起血管渗漏性的增强[4]。我们通过建立大鼠视网膜RIRI损伤动物模型，研究AQP1和VEGF的表达情况并探讨二者在视网膜RIRI损伤中表达的意义。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　健康成年SPF级Wistar大鼠56只，雌雄各半，体质量220±20g ，由甘肃中医学院动物实验中心提供。裂隙灯下检查角膜透明，瞳孔等大等圆，虹膜血管清晰，晶状体无混浊。将所选大鼠随机分为7组，分别为缺血再灌注后6，12，24，48h;3，7d组，正常对照组，每组8只大鼠。

　　1.2　方法

　　缺血再灌注模型的建立：大鼠称重，用体积分数100g/L水合氯醛3.5mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉满意后，将大鼠取俯卧位固定于鼠台上，随机选取每只大鼠的1眼造模，10g/L地卡因点眼局部麻醉，复方托吡卡胺散瞳，用氯霉素滴眼液冲洗结膜囊，将连接生理盐水瓶输液管的4号半头皮针沿颞侧角巩膜缘刺入大鼠眼前房，避免损伤虹膜和晶状体，胶布固定头皮针于大鼠同侧耳缘处。缓慢升高输液瓶至与大鼠实验眼垂直距离150cm处,此时眼压110mmHg (1mmHg =0.133kPa)，可见球结膜及虹膜迅速变白，视网膜颜色苍白，说明视网膜中央动脉的供血完全阻断。氯霉素眼液滴眼以保持角膜湿润并预防感染。持续形成高眼压造成视网膜缺血60min后，缓慢降低输液瓶高度至大鼠眼球水平，使眼压缓慢降低。关闭输液器，拔出输液针头，虹膜及球结膜颜色迅速恢复正常，眼底视网膜恢复橘红色，说明受阻血流重新开放，已形成再灌注。术毕结膜囊涂红霉素眼膏待清醒后回笼。实验主要试剂：兔抗大鼠AQP1多克隆抗体(Santa Cruz公司)，鼠抗VEGF单克隆抗体(Santa Cruz公司)，生物素化的羊抗兔和兔抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。光镜制片：缺血再灌注组和正常对照组均用过量麻醉处死大鼠，在大鼠眼球3∶00或9∶00方位做好标记后，迅速摘除眼球，保留视神经0.5～1mm，置于40g/L多聚甲醛磷酸缓冲液(pH7.4 )内4℃固定24h，去除眼前节，梯度乙醇脱水和二甲苯透明后，常规石蜡包埋。以平行于视神经矢状轴平面对视网膜进行连续切片，厚约5μm，置于预先用多聚赖氨酸处理的载玻片上，60℃温箱烤片过夜，HE染色，光镜观察各组视网膜组织内层结构的变化。免疫组化染色：石蜡切片二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，蒸馏水洗涤，微波热修复，自然冷却30min后，用蒸馏水和PBS缓冲液各洗涤3次，加内源性过氧化酶阻断剂阻断10min，再用PBS缓冲液洗涤3次后用正常动物非免疫血清封闭10min，甩干滴加一抗，4℃过夜，复温1h后PBS缓冲液洗涤3次，加生物素标记的二抗后，再用PBS洗涤3次，再加辣根酶标记的链酶卵白素工作液，PBS洗涤3次后DAB显色5min，镜下观察掌握染色深度，苏木素复染2min后盐酸乙醇分化，自来水冲洗后，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，封片。

　　统计学分析：采用SPSS 16.0统计软件，组间不同时间点作单因素方差分析并进行两两比较。数据均用±s表示，P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　HE染色结果

　　正常对照组大鼠视网膜各层结构排列整齐，共10层，与人的视网膜相似。缺血再灌注6h组视网膜各层均水肿，神经节细胞层细胞排列紊乱，出现空泡变性，内丛状层明显增厚，内核层和外核层间质排列疏松。12h组视网膜各层水肿较前减轻，3d组视网膜内层开始变薄，7d组视网膜内丛状层，内核层明显变薄。

　　2.2　免疫组织化学染色结果

　　细胞膜上出现棕黄色颗粒的细胞为免疫阳性细胞。正常对照组未能检测到VEGF的表达(图1A)，缺血再灌注组在再灌注后12h开始出现表达，以后表达逐渐加强，到再灌注后48h达到高峰(图1B)，以后开始减弱，7d仍可检测到其表达。缺血再灌注组VEGF的表达除6h组外与正常对照组相比均有统计学差异(P<0.01)，48h VEGF的表达与其余缺血再灌注组比较均有统计学差异(P<0.01，表1)，VEGF主要分布于视网膜的内层，视锥视杆细胞层亦有表达。AQP1在正常对照组也有表达，主要集中于视网膜的外层，即色素上皮层和视锥视杆层(图2A)，缺血再灌注7d组内层视网膜首次出现表达，主要是神经纤维层和神经节细胞层，并且外层视网膜表达较正常组增强(图2B)，与正常对照组和其余缺血再灌注组相比均有统计学差异(P<0.01，表1)。表1 各组视网膜VEGF和AQP1平均光密度的变化(略)

　　3　讨论

　　RIRI损伤造成的视网膜水肿，以往认为其机制是缺血、炎症介质等多种损伤因素所致血视网膜屏障(bloodretina barrier，BRB)破坏，血浆成分渗出，然而在检测视网膜水肿与荧光素渗漏时发现，少数患者局部或者整个视网膜的水肿程度与荧光素渗漏增加并不一致[5]。说明除视网膜血管渗漏外，还有其它机制参与了视网膜水肿的形成。研究认为神经活动所致视网膜局部积聚的多余水主要靠神经胶质细胞(Müller胶质细胞)介导的跨膜/跨屏障转运来完成的，且这一转运过程的分子机制与AQPs介导的快速跨膜水转运有关。因而AQPs的表达异常，可以造成视网膜的水代谢异常。AQPs是一类近年来颇受关注的调节水分子跨膜转运的膜蛋白。AQP1主要在无长突细胞的亚群，Müller胶质细胞的基部突起，光感受器细胞和视网膜的色素上皮层表达[6]。AQP1是第一个从人类红细胞上分离出来的水通道蛋白，分子量为28kDa ，最先称之膜内在蛋白(CHIP28)，是调节细胞间隙渗透压的水选择性通道[7]。Iandiev等[7]在升高眼内压制备的大鼠视网膜缺血再灌注损伤的模型中发现AQP1的表达发生了变化，正常组在视网膜外层表达，而模型组在内层视网膜也出现了表达，其推测可能与神经胶质细胞为了清除血管周围渗漏的水而反应性的出现AQP1的表达改变。我们在实验当中也发现AQP1在视网膜的内层神经节细胞层出现了表达，与Ianors Iandiev的研究相似，同样 Iandiev等[7]在链尿菌素建立的糖尿病大鼠模型的视网膜上也发现了AQP1的表达发生了变化。这种AQP1的表达异常，具体机制尚不清楚，推测可能为视网膜RIRI损伤后，氧自由基的生成增多，兴奋性氨基酸的释放，钙超载，造成了视网膜组织生物膜的损伤，引起大量水分子的渗漏和细胞的肿胀[8]。Na+是维持细胞正常体积的关键离子，细胞的肿胀与胞内Na+的减少密切相关，而RouzaireDubois等[9]在其最近研究中发现AQP1在大鼠神经节细胞的钠依赖性活动是细胞体积调节的一种新的机制，为了维持细胞的正常体积和清除视网膜积聚的水从而使AQP1的表达发生了变化。VEGF是目前已知的很强的促血管新生因子，缺氧是其最主要的诱导因素[10]。游志鹏[11]采取结扎颈总动脉阻断视网膜血流的方法，发现VEGF的表达在48h达到最强，以后开始减弱。我们发现12h开始出现VEGF的表达，48h达高峰，7d仍可见VEGF的表达。视网膜在缺血再灌注损伤后出现VEGF的表达增多，可能机制为，虽然血供恢复后，但是自由基导致细胞的呼吸链损伤，细胞仍处于一种缺氧状态，机体为了对抗缺氧，使VEGF的表达上调，其高表达增加了血管的渗透性，导致了视网膜的水肿，并且有可能导致新生血管的出现。在已有的研究中发现AQP1在早产儿视网膜病变中的新生血管中出现表达，推测其水的渗透性促使血管内皮细胞的迁移，参与了视网膜的新生血管化[12]。我们在本研究中发现视网膜RIRI损伤后VEGF和AQP1的表达增强，推测可能通过协同作用增加了血管的通透性，导致了视网膜的水肿，并通过促进内皮细胞的迁移，使视网膜出现新生血管，进一步损伤视网膜。

　　综上所述，视网膜RIRI损伤中，AQP1和VEGF的表达可能是导致视网膜水肿的主要因素之一。找到新的靶点，阻断二者的表达，减少视网膜的水肿和阻止视网膜的新生血管化，可能会减轻视网膜缺血再灌注造成的损伤，保护视功能。

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　　6　Iandiev I, Pannicke T, Biedermann B, et al. Ischemiareperfusion alters the immunolocalization of glial aquaporins in rat retina. Neurosci Lett 2006;408(2)：108112

　　7　Iandiev I, Pannicke T, Reichenbach A, et al. Diabetes alters the localization of glial aquaporins in rat retina. Neurosci Lett 2007;421(2)：132136

　　8　Ophir A, Berenshtein E, Kitrossky N, et al. Hydroxyl radical generation in the cat retina during reperfusion following ischemia. Exp Eye Res 1993;57(3)：351357

　　9　RouzaireDubois B, Ouanounou G, ORegan S, et al. Sodiumdependent activity of aquaporin1 in rat glioma cells: a new mechanism of cell volume regultion. Pflugers Arch 2009;457(5)：11871198

　　10　Aiello LP, Northrup JM, Keyt BA, et al. Hypoxic regulation of vascular endothelial growth factor in retinal cells. Arch Ophthalmol 1995;113(12)：15381544

　　11　游志鹏.血管内皮生长因子在视网膜缺血再灌注损伤中的表达.眼外伤职业眼病杂志 2004;26(11)：721723

　　12　Xun W, Liu Y, Qing G, et al. Aquaporin 1 expression in retinal neovascularization in a mouse model of retinopathy of prematurity. Prep Biochem Biotechnol 2009;39(2)：208217