大鼠外伤性白内障晶状体上皮细胞中MMP2和TIMP2的表达

　　作者：石云峰，王峰，谢志，张爽，廖伟 作者单位：(161006)中国黑龙江省齐齐哈尔市五官医院眼科;(150086)中国黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学眼科医院

　　【摘要】目的：探讨基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2，MMP2)及其抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase2，TIMP2)在大鼠外伤性白内障形成过程中所发挥的作用。方法：正常成年SD大鼠20只，体质量250～300g，建立单眼晶状体穿通伤后外伤性白内障模型，并随机分为伤后12，24，72，168h 4个时相组。用免疫组织化学染色法检测MMP2和TIMP2在各组晶状体上皮细胞(lens epithelial cell, LEC)中的表达情况。结果：外伤后12h晶状体开始出现混浊，并随时间延长而加重。MMP2 在各外伤组LEC中均有较强的阳性表达，而在正常对照眼中无表达。TIMP2 的表达在各组LEC中差异均无显著意义(P>0.05)。MMP2与TIMP2阳性表达率间无相关性(P>0.05)。 结论：MMP2参与了外伤性白内障形成的病理环节。MMP2和TIMP2表达失衡在外伤性白内障的发生和发展过程中发挥重要作用。

　　【关键词】 基质金属蛋白酶2;基质金属蛋白酶2抑制剂;外伤性白内障;晶状体上皮细胞

　　Expression of MMP2 and TIMP2 in the lens epithelial cell of cataract induced by contusion in rats

　　YunFeng Shi, Feng Wang, Zhi Xie, Shuang Zhang, Wei Liao

　　Deparment of Ophthalmology, the Eye & Ear Hospital of Qiqihar, Qiqihar 161006, Heilongjiang Province, China;Eye Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China

　　AbstractAIM: To investigate the expression and significance of matrix metalloproteinase2(MMP2) and tissue inhibitor of metalloproteinase2(TIMP2) in the rat traumatic cataract models.METHODS:Twenty healthy SD rats(weighing 250300g) were used to establish traumatic cataract model on left eyes and then divided into posttraumatic 12, 24, 72 and 168 hours groups randomly. The expression of MMP2 and TIMP2 in lens epithelial cells(LEC) were examined by immunohistochemistry staining.RESULTS: In the posttraumatic 12 hours, lens opacity began to appear and aggravated as the time went by.Immunohistochemical results showed positive MMP2 expression in the LEC of every traumatic groups. No expression of MMP2 was detected in the compared eyes without surgery. But there was no statistical significance for TIMP2 expression (P>0.05). There was no correlation between the expression of MMP2 and TIMP2 (P>0.05). CONCLUSION: MMP2 takes part in the formation process of traumatic cataract. The imbalance between the expression of MMP2 and TIMP2 may play a critical role in the generation and development of traumatic cataract.

　　

　　KEYWORDS: matrix metalloproteinase2; tissue inhibitor of metalloproteinase2; traumatic cataract; lens epithelial cell

　　0　引言

　　基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2, MMP2)是降解细胞外基质(extracellular matrix, ECM)和基底膜的一类重要酶类，金属蛋白酶组织抑制剂2(tissue inhibitor of metalloproteinase2, TIMP2)是MMP2的特异性抑制物，ECM的稳定主要依赖于MMP/TIMP间的动态平衡。MMP/TIMP系统在多种眼科疾病中所起的作用是近年来的研究热点。外伤性白内障是眼球发生穿孔伤或钝挫伤后常见并发症之一，发病率为36%～52%，也是眼外伤致盲的主要原因之一，占视力致残者的28.1%。许多研究表明机械性损伤引起的晶状体上皮细胞(lens epithelial cell，LEC)增生、移行和化生与外伤性白内障的发生发展密切相关，但目前尚无MMP2和TIMP2在外伤性白内障中发挥作用的相关报道。我们通过建立大鼠单眼外伤性白内障模型[1]，用免疫组织化学法检测外伤性白内障LEC中MMP2/TIMP2的表达情况。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　正常成年SD大鼠20只，雌雄不限，体质量250～300g(哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供)。即用型兔抗大鼠MMP2和TIMP2mAb(福州迈新生物技术有限公司)。SP试剂盒和DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)。免疫组化步骤按SP试剂盒操作。以PBS代替一抗作为阴性对照，阳性对照为购自福州迈新公司的标准阳性对照片。

　　1.2　方法

　　SD大鼠左眼进行人为外伤制造外伤性白内障，对侧眼作为对照。5g/L托品酰胺扩瞳，5g/L氯胺酮按10mL/kg比例ip麻醉，5g/L利多卡因滴眼，在手术显微镜下用一次性1mL注射器针头在角膜偏中央部位刺穿角膜，并用针头将晶状体前囊划开1.0mm×1.5mm切口，自晶状体中央沿前囊创口长轴方向划开数次，术毕结膜囊涂红霉素眼膏，术后每天5g/L托品酰胺扩瞳。术后将大鼠随机分为伤后12，24，72，168h 4个时相组，每组5只，在各时间点用裂隙灯显微镜观察晶状体混浊程度。术后12h可见晶状体在针头刺穿部位呈局限性混浊，24h混浊范围扩大，但仍为淡白色云雾状，72h混浊加深、范围更大，168h后大部分呈白色混浊，白色乳块状，此后白内障发展趋于稳定。对照组晶状体透明，未见明显混浊。将大鼠颈椎脱臼处死，摘取双眼眼球，40g/L多聚甲醛固定，做眼球前矢状面石蜡切片(厚度为5μm)。用免疫组织化学法检测LEC中MMP2和TIMP2的表达情况，步骤按SP试剂盒说明操作，光学显微镜观察。以未行手术的对侧眼为对照，处理同上。空白对照不加一抗，阳性对照自福州迈新公司提供的阳性对照片。MMP2/TIMP2阳性表达均为细胞胞质有呈黄色、棕黄色染色颗粒。每个晶状体标本选3张切片，200倍光学显微镜下计数全部LEC数和染色为阳性的细胞数，并计算其所占的百分比即为阳性表达率。阳性表达率0%为阴性(-);1%～25%为弱阳性(+);26%～50%为阳性(++);>50%为强阳性(+++)。

　　统计学分析：运用SPSS 11.0统计分析软件，两组间率的比较采用 χ2 检验，两两指标相关性分析采用Spearman等级相关检验，以P<0.05为差异有显著意义。

　　2　结果

　　2.1　MMP2的表达

　　外伤后12h，晶状体前囊膜破裂处的LEC还没有明显的增生迹象，但胞质中已出现MMP2阳性表达的淡黄色颗粒着染(图1A);外伤后72h，前囊膜下上皮细胞增生呈多层排列，阳性着染明显;外伤后168h，前囊膜下上皮细胞增生更明显，并向后囊膜延伸，后囊膜出现移行的上皮细胞，阳性着染增强(图1B)。对侧眼组各时项的LEC胞质中均未见明显黄色、棕黄色颗粒(图1C)。外伤后不同时相的LEC中MMP2的平均阳性表达率(%)为41.4±8.9，52.6±7.5，71.4±9.8和88.2±8.0，每一时相进行组间比较差异均有显著性(P<0.05)。

　　2.2　TIMP2的表达

　　实验眼组和对侧眼组各时间的LEC中，均可见TIMP2阳性表达，胞质内有棕黄色颗粒。TIMP2的表达在外伤性白内障与正常晶状体相比较，差异无显著意义(80% vs 85%，P>0.05)。

　　2.3　MMP2和TIMP2表达的相关性

　　将外伤性白内障组和对侧眼组的LEC中MMP2和TIMP2的表达情况作Spearman等级相关分析。MMP2和TIMP2的阳性表达率间无相关性(r=0.062，P>0.05)。

　　3　讨论

　　外伤性白内障是眼外伤的常见并发症，其病理表现既有晶体蛋白的变性混浊，又有LEC的过度增生和迁移。LEC是晶状体内具有分裂能力的细胞，在维持晶状体水电解质平衡、营养物质转运、气体交换等方面具有重要作用。该上皮细胞不断分化为晶状体纤维并形成晶状体囊膜，晶状体囊膜由LEC分泌的基底膜样物质聚集而成，在调节细胞正常的黏附、增殖、移行、分化等生物学行为中起重要作用。近年来有学者认为，外伤性白内障是由于细胞外基质(extracellular marix, ECM)聚集、降解异常和LEC转化所致的一种纤维化疾病。Seomun等[2]研究表明，ECM的异常降解能改变LEC和ECM间的相互作用，引起细胞转化和基因表达异常，从而导致晶状体前、后囊膜下纤维化。

　　晶状体囊是一层包绕整个晶状体、具有弹性的透明基底膜，由胶原网状结构组成，组织间隙充满黏多糖。主要成分为Ⅳ型胶原蛋白和层黏连蛋白，是MMP2的特异性底物[3]，TIMP2是MMP2的特异性抑制剂，两者在调节ECM的动态平衡中发挥重要作用。国内有学者对糖尿病性白内障进行研究[4]，发现患者的LEC中MMP2表达水平增高，而TIMP2的表达水平未伴随MMP2增高，两者的比例失衡使ECM中的Ⅳ型胶原和层黏连蛋白等降解增多，使LEC发生上皮间质化，并最终诱导了囊膜下型白内障的形成。以上实验说明，MMP/TIMP在白内障的发病机制中占重要地位。我们通过成功建立鼠外伤性白内障动物模型，观察伤后12，24，72，168h 4个时相LEC的增生和转移情况。用免疫组化法检测外伤性白内障和正常LEC中MMP2的表达情况，结果发现正常LEC中无表达。而外伤性白内障中，从伤后尚无细胞增生的第12h，到出现明显增生的第72h，以及到细胞发生明显迁移的第168h，MMP2在LEC内部均呈较强的阳性表达，这提示MMP2涉及LEC异常行为的多个环节。我们推断外伤性白内障中，晶状体上皮细胞MMP2表达增多，使晶状体ECM降解增多，正常上皮细胞周围的ECM成分发生改变，ECM的正常结构和生理功能被破坏，影响了上皮细胞的生物活性及功能，导致细胞转化和基因表达异常，晶状体纤维再生、基底膜样物质的复制以及胶原合成的释放，引起囊膜下纤维化病变。因此，MMP2可能与外伤性白内障的发生发展密切相关。

　　正常生理状态时MMPs与TIMPs协同产生，维持动态平衡，在组织重建、细胞迁移、血管生成、伤口愈合等过程中发挥重要作用，这种平衡一旦被打破，EMC代谢发生异常，可导致各种疾病并促进疾病恶化。Kawashima等[5]应用免疫组化法对白内障术后的晶状体囊膜进行检测，发现有TIMP1，2的阳性表达。Sachdev等[6]通过免疫组化、ELISA、酶谱分析等方法对白内障和正常晶状体进行对比研究，证实均有TIMP1，2，3的表达。因此，TIMPs在白内障及正常组织中均有阳性表达。TIMP2是MMP2的特异性抑制剂，一般随MMP2的表达而表达，两者相互作用、相互抗衡，其含量比例与ECM中各成分是否被破坏有关。本研究中，TIMP2在外伤性白内障和正常LEC中均有阳性表达，同Kawashima等报道的结果相一致，且两者阳性率相比较差异无显著性。另外，TIMP2在外伤性白内障组LEC中的表达与MMP2的表达无相关性。这些都说明TIMP2的表达并未随着MMP2表达的增多而相应增多，MMP2和TIMP2的表达明显失衡。由此可见，在外伤性白内障的病程中，LEC表达MMP2数量增多，而其抑制剂的拮抗作用未相应提高，二者比例的失衡使晶状体ECM中的各种成分降解增多，导致正常LEC赖以增殖和生存的ECM组成成分发生改变，诱发白内障的形成。MMP2和TIMP2在体内受多种形式的调控，如转录水平的调控、潜酶活化、其他抑制因子及负反馈调节等[7]。机体内存在多种细胞因子和生长因子，它们可以调节LEC增殖和ECM合成，也可诱导或上调MMP和TIMP的表达，反过来MMP和TIMP对这些激活的细胞也具有促增殖作用。因此，在外伤性白内障的发生发展过程中MMP2/TIMP2，ECM、细胞因子、生长因子等诸多因素间存在着复杂的网络调控机制，目前对这类复杂调控机制的认识还很肤浅，有待今后开展更深入研究。

　　【参考文献】

　　1　万光明,张效房.外伤性白内障动物模型的制作探讨.眼外伤职业眼病杂志 2002;24(6)：617618

　　2　Seomun Y, Kim J, Lee EH, et al. Overexpression of matrix metalloproteinase2 mediates phenotypic transformation of lens epithelial cells. Biochem J 2001;358(Pt1):4148

　　3　Mackay AR, Gomez DE, Cottam DW, et al. Identification of the 72kDa(MMP2) and 92kDa (MMP9) gelatinase / type IV collagenase in preparations of laminin and Matrige1. Biotechniques 1993;15(6):10481051

　　4　徐国兴, 胡建章, 郑卫东, 等. 基质金属蛋白酶2和金属蛋白酶2组织抑制因子及转化生长因子β1在糖尿病性白内障患者晶状体上皮细胞的表达及意义.中华眼科杂志 2003;39(7): 411414

　　5　Kawashima Y, Saika S, Miyamoto T, et al. Matrix metalloproteinases and tissue inhibttors of metalloproteinases of fibrous humans lens capsules with intraocular lenses. Cur Eye Res 2000;21(6): 962967

　　6　Sachdev NH, Glrolamo ND, Nolan TM, et al. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in the human lens: implications for cortical cataract formationl. Invest Ophthalmol Vis Sci 2004;45(1):40754082

　　7　Tamiya S, Wormstone IM, Marcantonio JM, et al. Induction of matrix metalloproteinases 2 and 9 following stress to the lens. Exp Eye Res 2000;71(6):591597