RNA干扰在眼底疾病中的新进展

　　作者：孟博，雷宁玉 作者单位：(256603)中国山东省滨州市，滨州医学院附属医院眼科

　　【摘要】RNA干扰(RNAi)发现，改变了人们对细胞基因调控的传统理解。这种技术具有传统治疗方法无可比拟的优势和潜力，因此近些年来越来越受全世界眼科医师的重视。目前，虽然在临床应用中还存在不少问题，但是RNAi必将为眼科疾病的治疗带来新的前景。我们就RNAi在眼底方面的研究进行综述。

　　【关键词】 RNA干扰;眼底病;基因沉默

　　Study on RNA interference technology in fundus diseases

　　Bo Meng, NingYu Lei

　　Foundation item:Program of Department of Education in Shandong Province, China(No.J05L12)

　　Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256603, Shandong Province, China

　　Abstract　The discovery of RNA interference(RNAi)has changed people's traditional concepts of the gene.This technique posseses advantages and potentials that traditional therapies can not compare especially in terms of its specificity and efficiency,and it is drawing more and more attentions from ophthalmologists all over the world these year. Although there are still a lot of problems in clinical use at present,various kinds of related experimental results make us firmly believe that RNAi will surely bring a new epoch for curing diseases in ophthalmology.This article provides an overview on some of the latest advances in fundus.

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　　KEYWORDS: RNA interference; fundus diseases; gene silencing

　　0　引言

　　RNA干扰(RNA Interference,RNAi)是指mRNA降解所引起的转录后水平的基因沉默(Posttranscriptional Gene Silencing,PTGS)[1]。这种技术的应用为体内和体外基因表达的抑制提供了新的方法[1]。尽管siRNAs和反义寡核苷酸都是通过WastonCrick碱基互补配对原理和目标mRNA结合[2,3]，但是相比之下，siRNAs具有更强的优势和潜力[4]，可能为眼底方面疾病的治疗带来新的前景。我们就RNAi在眼底方面的研究进行综述。

　　1　RNA干扰技术

　　1.1　RNAi的发现

　　1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)的par1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本想利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强，但得到的结果是二者都同样地切断了par1基因的表达途径[5]。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。1998年， Fire和Mello通过实验发现，正义RNA抑制基因表达的现象及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA(dsRNA)[1,6]而引起。他们将单链RNA纯化后注射线虫时，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反[69]。他们将这种现象称作RNAi[1]。1999年，人们发现RNA干扰现象广泛存在于几乎所有的真核生物中细胞。2000年，Hammond和Zamore提出了RNAi作用机制模型[3,10]。2001年，人们利用RNAi技术成功诱导出培养的哺乳动物细胞基因沉默现象[11]。2006年，美国科学家Fire和Mello[1214]发现了RNAi[1]，获得了诺贝尔生理学或医学奖。

　　1.2　RNAi的作用机制

　　RNAi的作用机制尚不十分清楚，目前普遍认为RNAi很可能都是通过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA，抑制相应基因的表达，属于PTGS[6]。现已初步阐明dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步：(1)一种称为Dicer的RNaseⅢ样核酸酶在ATP参与下把dsRNA[1,6]切割加工成长21～23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNAs)[1517]。(2)siRNAs在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNAinduced silencing complex,RISC)[18,19]。RISC在单链siRNAs引导下识别互补的mRNA[20]，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNAs引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA[18,21,22]。

　　1.3　RNAi的重要特征

　　1.3.1　转录后水平的基因沉默

　　DNA能够在细胞核中被稳定转录，但由dsRNA介导形成的RISC[18]特异地降解靶mRNA，使细胞质里无相应的mRNA存在,抑制了相应基因的表达，导致了转录后水平的基因沉默。

　　1.3.2　高特异性

　　dsRNA特异地抑制干扰RNA同源序列的靶基因表达，而对不相关序列的表达无干扰作用，这是由siRNAs的反义链[19,23,24]与mRNA同源区互补配对所决定的。siRNAs除正义链3’端的两个碱基在序列识别中不起主要作用外，其他单个碱基改变就可能使RNAi失效，而针对同源基因共有序列的RNAi则导致同源基因共同失活[3,18,21,22]。

　　1.3.3　高效性

　　RNAi抑制基因表达具有很高的效率，这是通过催化放大的方式进行的。siRNAs不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。新合成的长链dsRNA同样可被RNaseⅢ样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNAs。次级siRNAs又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。另外，当mRNA降解时，siRNAs可连续地发挥降解作用。

　　1.3.4　遗传性

　　Fire等[1]将dsRNA注射入秀丽新线虫的性腺后，在其第1子代中也诱导出了同样的基因抑制现象，这说明在原核生物中RNAi具有可遗传性。随后Clemens等在果蝇培养细胞中也发现了类似的现象。

　　2　RNAi在眼底病中的研究进展

　　由于RNAi在疾病治疗方面具有潜在的优势[4,25]，近年来备受眼科医师的重视。目前，国内外在眼底疾病方面已经开展了大量的相关研究。

　　2.1　眼底新生血管性疾病

　　血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF)是功能最强的血管形成促进因子，在脉络膜新生血管性疾病和缺血性视网膜病变的发生及发展中发挥着重要作用。Forooghian等[26]通过RNAi在RPE中分别促成了VEGF和低氧诱导因子(HIF1)的基因沉默，低氧环境下培养RPE，然后用酶联免疫吸附实验检测培养基中有VEGF和HIF1存在,最后将此培养基提取出来用于培养人脐静脉血内皮细胞。通过定量检测毛细血管的形成，得出了针对VEGF的RNAi使VEGF和一些其它的临床上重要的血管形成因子，如血管形成因子、IL6，IL8、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)、TGF1等的减少;而针对HIF1的RNAi虽然使VEGF、血管形成因子、TGF1的表达量减少，但是其它一些血管生成因子如IL6，IL8，MCP1的量则升高。从而验证了VEGF在新生血管形成中的主要作用，并预示了RNAi在眼部新生血管性疾病治疗的新前景。

　　2.2　视网膜遗传性疾病

　　视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)属于视锥、视杆营养不良，是一组以进行性感光细胞及色素上皮功能丧失为共同表现的遗传性视网膜变性疾病[9]。遗传异质性是主要以遗传为主的疾病治疗中的一大难题，RP具有典型的遗传异质性。目前已分离出多种致病基因，视紫红质基因是其中的一种，在这一型RP患者中，就有不少于100个该基因的突变[27]，在基因水平分别补充缺失的基因或清除异常基因有望在病因上治愈RP。Lewin通过实验，发现锚定视紫红质P23H突变的核糖体酶可以使转基因鼠延缓感光受体的退变[7]。由于突变型等位基因和野生型等位基因在RNAi中都可以被抑制，OReilly等[9]通过将siRNAs或短发夹RNA(short hairpin RNAs,shRNAs)，与不受它们抑制的被密码子修饰的野生型替代基因，一并转染到腺病毒相关病毒(AAV)[28]中，发现了令人振奋的结果。因此，RNAi和基因替代技术的联合应用，在未来有望克服突变异质性带来的治疗障碍，从而治愈眼部遗传性疾病。

　　2.3　视神经疾病

　　目前视神经疾病主要以改善微循环、积极抗炎等对症治疗为主。但是，单纯抗炎及使用非特异性免疫抑制剂常会导致严重毒副作用。并且由于血房水屏障和血视网膜屏障的存在，传统的药物很难在病灶部位达到治疗浓度，而用转基因法导入dsRNA产生的RNAi，特别是基于它的特异性和潜力，有望取代反义RNA治疗技术[4]作为一种新型的治疗策略，为眼科视神经疾病如视神经炎、Leber氏遗传性视神经病(LHON)[29]、多发性硬化的治疗带来新的前景。

　　2.4　近视的治疗

　　近视是一种发病率非常高的疾病，轻度近视对人们的生产和生活不会造成太大的影响。但是近视度数较高者可发生程度不等的眼底改变，如豹纹状眼底、新生血管膜的形成、黄斑部出血、视网膜脱离等，情况严重者可以导致不可逆性眼底损伤甚至致盲。虽然我们可以通过激光光凝、后巩膜加固术等方法进行治疗，但其中大部分方法因有扩大损伤范围可能或操作复杂而受到一定限制。国内外研究发现，这种近视主要以遗传为主，已发现改变的基因有：Lumican和Fibromodulin[30]、转化生长因子β诱导因子、成骨蛋白2等十多种[31,32]，表明病理性近视具有遗传异质性，与单纯性近视不同。我们可以用RNAi制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应，具有投入少，周期短，操作简单等优势。

　　2.5　眼底肿瘤的治疗

　　肿瘤治疗是疾病治疗的重点和难点，迄今为止尚没有特异有效的治疗药物。我们可以使用DNA芯片发现肿瘤组织中表达失调的基因，再利用siRNAs敲除点突变激活的癌基因，特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，然后观察对细胞生长等方面的影响。目前已有实验证明分别针对EZH2[33]、survivin[34]和Ku80[35]的RNAi在前列腺癌、结肠癌和宫颈癌的生长中有显著抑制作用，眼科领域中相关实验也已展开，Jia等[36]通过siRNAs特异性地抑制了视网膜母细胞瘤的异体动物模型的血管内皮生长因子的表达，从而有效地抑制了肿瘤的生长。

　　3　RNAi在眼科应用中存在的问题

　　目前siRNAs转染哺乳动物细胞内效率低下，如何将siRNAs有效转染入体内成为RNAi在临床上应用的最大障碍[37]。转染的方法有多种，如电穿孔、脂质体载体介导、显微注射技术、DNA载体转染等，但效果都不甚理想。目前国内外研究倾向于载体的构建上，如Zhao等[38]以pGenSill质粒为载体，利用RNAi技术功构建出了抑制LEDGFp52表达的小干扰RNA重组体。但是重组质粒载体、逆转录病毒载体等各种载体可能引起机体毒性免疫反应，具有潜在危险性。另外，siRNAs诱导基因沉默有一定剂量效应，注射中加入大体积的溶液会增加对实验动物的刺激，导致实验数据不准，而且导入的siRNAs与宿主基因组整合可能导致生物群体其它遗传特征改变。最后，由于眼部解剖屏障结构，在身体其它部位有效的RNAi可能不适用于眼部。虽然科学家已通过实验分别在短尾猴和小鼠中玻璃体和视网膜下成功注射了siRNAs，为siRNAs的局部用药提供了可能，但是要想真正应用于临床还需要大量的研究。

　　4　总结

　　RNAi的发现改变了人们对细胞基因调控的传统理解，具有传统治疗方法无可比拟的优势和潜力，为眼部疾病基因治疗开创了新的道路。但是这种技术在实际应用中还存在不少问题，比如如何在目的mRNA上选择2123nt左右的序列作为siRNAs作用靶点、如何进行有效的化学修饰以提高其稳定性和特异性、如何构建高效且毒性免疫反应小的载体等，且siRNAs触发哺乳动物细胞RNAi的研究，较之在低等生物中更为复杂和困难，因此还需要更多的探索。但是目前关于siRNAs的研究结果使我们深信，siRNAs非常有希望被用于临床，有着广阔的应用前景。

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