低氧条件下大鼠视网膜葡萄糖调节蛋白的表达

　　作者：刘斐,周占宇,丰慧 刘斐(1984)，女，在读硕士研究生。 作者单位：(青岛大学医学院附属医院眼科,山东 青岛 266003)

　　【摘要】 目的 研究低氧条件下葡萄糖调节蛋白(grp78)在大鼠视网膜中的表达情况,探讨内质网应激在视网膜低氧条件下的作用及其机制。方法 Wistar大鼠30只,随机分为正常对照组和实验组,正常对照组饲养于常氧环境中,实验组饲养于低氧仓。实验组又按照在低氧仓饲养时间分为6、12、24、48和72 h等5个亚组,并于这5个时间点处死大鼠,摘除眼球,应用免疫组织化学方法和RTPCR法测定各组大鼠grp78蛋白表达。结果 grp78在正常大鼠视网膜中少量表达,低氧条件下6 h开始升高,24 h到达高峰,72 h降至正常水平。低氧条件下6、12、24、48 h表达量与正常对照组比较差异有显著性(F=32.22,q=5.32～11.53,P<0.05);72 h 视网膜grp78的表达与正常对照组相比,差异无显著性(q=2.79,P >0.05)。结论 低氧条件下grp78在大鼠视网膜中表达,它参与了大鼠视网膜低氧损伤的发生机制。

　　【关键词】 葡萄糖调节蛋白;视网膜;缺氧;大鼠,Wistar

　　EXPRESSION OF GLUCOSE REGULATED PROTEIN IN RAT RETINA UNDER HYPOXIA

　　LIU FEI, ZHOU ZHANYU, FENG HUI

　　Department of Ophthalmology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ;

　　[ABSTRACT] Objective To investigate the expression of glucose regulated protein (grp78) under hypoxia and to study the effect and mechanism of endoplasmic reticulum stress. Methods Thirty wistar rats were randomly divided into normal control group and experimental group. The rats in the experimental group were killed after hypoxia breeding for 6, 12, 24, 48 and72 hours, respectively; the eyeballs were then removed. The expression of grp78 was studied immunohistochemically and by using reverse transcriptase PCR (RTPCR). Results Expression of grp78 was weak in normal retina, but increased after 6 hours of hypoxia, reached its peak after 24 hours of hypoxia and fell back to the normal level after 72 hours. The differences in expressions of grp78 in the rats after hypoxia breeding for 6, 12, 24 and 48 hours were significant, compared with that of control group (F=32.22;q=5.32-11.53;P<0.05). The difference between breeding of 72 h group and the control group was not significant (q=2.79,P>0.05). Conclusion grp78 is strongly expressed in rat retina under hypoxia and involves in the mechanism of retinal hypoxic injury.

　　[KEY WORDS] glucose regulated protein; retinal; anoxia; rats, Wistar

　　低氧使细胞的生理功能发生改变， 造成全身组织和器官失灌而损伤。内质网应激是指在缺血、低氧或氧化应激等各种因素使细胞内质网生理功能紊乱时,细胞启动的自我保护反应机制,它有利于细胞内环境稳态的恢复和维持细胞存活[1]。近年来对于内质网应激与全身多种疾病发生发展的关系研究较多。视网膜结构复杂而且代谢旺盛,对低氧等刺激敏感,本实验观察大鼠视网膜低氧不同时间内质网应激标志物——葡萄糖调节蛋白(grp78)在视网膜组织中的表达变化，探讨内质网应激在大鼠低氧条件下的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验材料

　　成年Wistar 大鼠30 只，雌雄不限,体质量为220～250 g，由青岛大学医学院实验动物中心提供， 室温饲养。兔抗鼠grp78 多克隆抗体(美国Stressgen公司),免疫组织化学Biotin SP2HRP Kit(北京中杉公司),Trizol(Invitrogen公司),M2MLV 逆转录酶、rTaq 酶(Takara 公司), 引物设计合成由大连宝生物公司完成。

　　1.2 低氧模型的建立及实验分组

　　用有机玻璃(厚度4 cm)制成低氧仓，体积为100 cm×60 cm×60 cm，三氯甲烷封侧面，仓体上面开一直径1 cm的出气孔，侧面开一直径1 cm的进气孔，通过三通管分别接氮气和压缩空气。用玻璃转子流量计(沈阳市北量流量仪器厂)控制流量。Wistar大鼠30只，随机分为正常对照组(n=5)和实验组(n=25)，正常对照组饲养于常氧环境中，实验组饲养于氧体积分数为0.05的低氧仓。实验组又按照在低氧仓饲养时间分为6、12、24、48和72 h等5个亚组，并于这5个时间点处死大鼠(每次5只)，摘除眼球。常规方法制备组织石蜡标本。分别用免疫组织化学染色方法和RTPCR法测定grp78的表达。

　　1.3 免疫组织化学染色

　　石蜡切片常规脱蜡复水，按照免疫组织化学试剂盒说明行SP法染色,阴性对照采用PBS代替一抗。显微镜下观察视网膜组织中grp78的表达情况,染色阳性反应物质表现为棕黄色颗粒,每组标本取5张切片,每张切片取5个视野,数码照相机采集图像,用Imageproplus 6.0图像分析软件测定细胞平均吸光度(A)值。

　　1.4 逆转录多聚酶链式反应(RTPCR)

　　1.4.1 总RNA提取

　　大鼠处死后立即摘除眼球,沿角巩膜缘撕除角膜,小心拨除晶状体和玻璃体,完整分离视网膜组织,研磨后加入1 mL的trizol,提取总RNA,紫外线分光光度计测定RNA含量。

　　1.4.2 RT反应

　　按照试剂盒说明书进行。

　　1.4.3 PCR反应

　　grp78引物序列为:上游5′AGCCCACCGTAACAAT2CAAG3′,下游5′TCCAGCCATTCGATCTTTTC3′,预计扩增片段长度445 bp,βactin用作内参照(片段长度265 bp)，引物合成参照文献[2]方法。反应条件:95 ℃预变性3 min; 95 ℃变性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,共30个循环;最后72 ℃再延伸10 min。取5 μL PCR产物,以12 g/L琼脂糖凝胶电泳分离目的基因片段,溴化乙锭染色,紫外线灯下观察并摄片,经图像分析系统测定A值,应用半定量法进行grp78 mRNA定量测定,以基因产物A值和内参照A值比表示。

　　1.5 统计学处理

　　采用 SPSS 11.5和PPMS 1.5[3]统计分析软件进行数据处理,结果以±s表示,数据间比较采用单因素方差分析及SNKq检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组视网膜中grp78表达的比较

　　对照组大鼠视网膜组织grp78弱阳性表达,主要分布于视网膜节细胞层和内核层。低氧条件 6 h grp78的表达开始升高,仍表达在视网膜节细胞层和内核层，与对照组相比差异有显著性(q=5.32,P<0.05);12 h即可见grp78表达明显增多(q=9.37,P<0.01);grp78的表达高峰出现在24 h(q=15.14,P<0.01);48 h grp78表达开始下降,但仍高于正常对照组(q=11.53,P<0.01);72 h组grp78的表达与正常对照组相比，差异无统计学意义(q=2.80,P>0.05)。 见表1。

　　2.2 RTPCR检测

　　grp78 mRNA与内参照GAPDH mRNA的扩增产物片段长度分别为445、265 bp，与预期相符。内参照基因扩增产物均明显可见，各组视网膜组织grp78 mRNA的RTPCR产物电泳结果见图1。半定量分析的结果显示,对照组大鼠视网膜组织中grp78 mRNA有少量表达。低氧12 h即可见grp78 mRNA表达明显增多(F=183.61，q=7.83,P<0.01);grp78 mRNA的表达高峰出现在24 h(q=32.33,P<0.01);48 h grp78 mRNA表达开始下降，但仍高于对照组(q=23.48,P<0.01);72 h grp78 mRNA的表达与正常对照组相比，差异无统计学意义(q=0.34,P>0.05)。见表1。表1 各组视网膜中grp78及grp78 mRNA表达的比较(略)

　　3 讨 论

　　视网膜是高度分化的神经组织，中枢神经系统对低氧最敏感，在人体的感官系统中，视网膜的代谢非常旺盛，主要由有氧代谢提供能量，对低氧的耐受性最低，机体内血氧的浓度及其弥散入组织的水平对维持视网膜组织的正常生理功能起着重要的作用。大量的研究表明，低氧对视网膜的神经元损伤，尤其是神经节细胞的损伤明显[4]。早在1988年,DAVID发现处于低氧环境中的鸡胚胎视网膜内核层、内网状层及神经节细胞层受损。低氧24 h可导致视网膜所有类型的细胞数明显下降[5]。

　　有研究表明，低氧导致的视网膜神经节细胞损伤与内质网应激反应的发生有关。内质网应激反应是细胞的一种自我保护性机制,以恢复内质网稳态,维持生存。但是过强或长时间的内质网应激反应可以引起细胞凋亡。一些损伤因素如低氧、 葡萄糖或氨基酸等营养物质不足,肽链在内质网中折叠受阻,内质网中分泌蛋白超负荷、病毒感染、 基因突变、 内质网与胞质间钙离子浓度差失调等都可成为内质网应激的重要诱因[6]。细胞为了生存产生针对内质网应激的反应,称为内质网应激反应。grp78又名免疫球蛋白重链结合蛋白(bip)，被认为是内质网应激反应的标志性分子，其生理状态下表达很低，主要功能是作为分子伴侣参与新生多肽链的折叠、装配和转运;在缺血、低氧、低糖、氧化应激、钙离子失衡等不利环境应激下引起内质网应激反应，导致大量多肽链在内质网内变性、积聚，此时grp78的表达量显著增高，一方面协助变性蛋白进行重新折叠、装配及跨膜转运，缓解内质网压力;另一方面将无法恢复的蛋白质转移给蛋白降解系统降解，从而避免细胞进一步受到伤害，它提高了细胞在应激情况下的生存能力和促进应激后的细胞康复[7]。

　　一些眼底疾病如糖尿病性视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞(缺血型)、视网膜中央动脉阻塞等, 可导致视网膜组织低氧[8]。在理论上，内质网应激反应参与了视网膜低氧性病变的发病机制。本实验构建视网膜低氧模型，观察大鼠低氧条件下不同时间段grp78的表达变化。结果显示,在正常视网膜组织中grp78少量表达,主要分布在 RGC层和内核层,低氧条件下6 h grp78 mRNA和蛋白表达均升高,24 h表达升高达到高峰,48 h后表达有所下降。表明低氧条件生存24 h时内质网自稳系统的调节作用达到最佳水平,低氧条件生存后48 h grp78的表达下降可能与低氧细胞的内质网稳态恢复有关,也可能是由于内质网自稳系统遭到了破坏,不能通过增加grp78的表达来结束内质网应激状态,细胞启动了凋亡通路。本研究结果提示，grp78的动态表达可能与低氧导致的视网膜损伤的进展密切相关,同时也提示了一种通过诱导内源性grp78生成来延缓低氧导致的视网膜损伤发展的新思路。低氧导致的视网膜损伤的发病机制是多因素、多途径的结果,若早期在内质网应激环节上加以干预,有可能为延缓低氧导致的视网膜损伤的发展提供新的治疗途径。

　　【参考文献】

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