氮酮促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞及毒性的实验研究

 作者：毛晓春　李贵刚　张虹作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科，湖北 武汉 430030  【摘要】  　　目的 探讨氮酮（ＡＺＯＮＥ）促进脂质体介导质粒ＤＮＡ 转染兔角膜内皮细胞的作用及其对细胞活性的影响。方法 采用细胞培养方法,利用绿色荧光蛋白基因做报告基因,配制不同转染液，脂质体联合ｐＥＧＦＰ－Ｎ１、氮酮联合脂质体及ｐＥＧＦＰ－Ｎ１、氮酮联合ｐＥＧＦＰ－Ｎ１ 、单纯ｐＥＧＦＰ－Ｎ１、单纯脂质体、单纯氮酮，分别处理兔角膜内皮细胞,荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的表达。用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ＥＧＦＰｍＲＮＡ表达情况。采用ＭＴＴ法研究不同转染液对细胞活性的影响。结果 单纯氮酮、单纯脂质体及对照组处理的细胞不表达绿色荧光蛋白。氮酮联合脂质体及ｐＥＧＦＰ２Ｎ１ 对兔角膜内皮细胞的转染效率为４２.６％，脂质体联合ｐＥＧＦＰ２Ｎ１ 组的转染效率为２２.４％，氮酮联合PEGFP-N1组的转染效率为7.2%，单组质粒组的转染效率为１％。氮酮加脂质体加ＰＥＧＦＰ－Ｎ１组转染效率高于其他转染组（Ｐ ＜０.０１）。各组转染液对角膜内皮细胞活性无影响。结论 氮酮可促进脂质体介导质粒ＤＮＡ 转染兔角膜内皮细胞,在有效的转染浓度下对细胞无明显毒性，有望成为促进角膜内皮细胞基因转染的新型试剂。 【关键词】  氮酮；角膜；内皮细胞；脂质体；基因转染　　氮酮是近年来开发的一种可以促进药物皮肤通透性的化学试剂，其作用机制是使细胞脂质层开裂，有利于药物通过［１］。以往研究表明，低浓度的氮酮即可使细菌细胞膜溶解，因此具有杀灭细菌的作用。与此相类似的现象为电子穿孔现象，其原理是通过制造暂时开放的细胞膜裂孔，介导外源基因向细胞内的转入，因此氮酮有可能在促进眼部药物通透性和基因转染方面发挥作用［２］。本研究采用体外实验的方法，观察水溶性氮酮对脂质体介导质粒ＤＮＡ转染兔角膜内皮细胞的情况及其对细胞活性的影响，旨在为氮酮在基因转染方面的应用奠定基础。

    １  材料和方法

    １．１  动物和试剂  清洁级新西兰大白兔，同济医学院实验动物中心提供。主要试剂：水溶性氮酮（湖北襄西化学工业有限公司）；ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００ （美国 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）；ｐＥＧＦＰ－Ｎ１（美国ＣｌｏｎＴｅｃｈ公司）；ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培养基及胎牛血清（美国Ｇｉｂｃｏ公司）；质粒快速提取试剂盒（中国博大泰克公司）。

    １．２  方法

    １.２.１  角膜内皮细胞培养  揭膜法取材，撕下带有内皮细胞的后弹力层， 剪切成２ ｍｍ × ２ ｍｍ大小组织块，内皮面向上置于培养皿中，加培养液，置于３７℃，５％ＣＯ２培养箱中培养。原代培养兔角膜内皮细胞，每２~３日换液一次，８０％融合后采用０.１２５％胰蛋白酶消化传代。

    １.２.２  ｐＥＧＦＰ－Ｎ１  质粒制备：ｐＥＧＦＰ－Ｎ１ 转化大肠杆菌ＤＨ５α，卡那霉素（５０ ?滋ｇ／ｍｌ） 筛选阳性菌落，ＬＢ培养基扩大培养，用质粒提取试剂盒提取ｐＥＧＦＰ－Ｎ１基因。所得质粒Ａ２６０／Ａ２８０ 为１.８１２，含量为０.１５～０.２５ ?滋ｇ／?滋ｌ。

    １.２.３  氮酮配制  以无血清的Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培养基充分溶解氮酮，使其浓度为０.１ ｇ/Ｌ，室温避光保存。

    １.２.４  实验分组  ?譹?訛脂质体＋ ｐＥＧＦＰ－Ｎ１。?譺?訛氮酮＋脂质体＋ ｐＥＧＦＰ－Ｎ１。?譻?訛氮酮＋ ｐＥＧＦＰ－Ｎ１。?譼?訛单纯ｐＥＧＦＰ－Ｎ１。?譽?訛单纯氮酮。?譾?訛单纯脂质体。?譿?訛无血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ为对照组。

１.２.５  转染细胞  取第３～第４代细胞，转染前分别将１×１０６个角膜内皮细胞接种于6孔板中，转染当天细胞生长至８０％～８５％融合。脂质体ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００的转染按试剂说明书进行，转染前用无血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ １ｍｌ洗涤细胞两次，每种细胞分别加入上述不同转染液，其中脂质体与ｐＥＧＦＰ－Ｎ１质量比为９ ?滋ｌ脂质体／３ ?滋ｇ 质粒，２，３，５组中氮酮浓度为０.１ ｇ/L，体积为１ ｍｌ，与细胞作用时间均为５ min，将氮酮清除干净，Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ洗涤细胞两次，再加入质粒或脂质体与ＤＮＡ复合物。３７℃、５％ＣＯ２ 培养箱中培养５ ｈ，吸去培养液，加入正常培养基，继续培养４８ ｈ。

    以上各孔重复3次，以排除实验偶然性的影响

    １.２.６  荧光显微镜观察及转染效率测定  于倒置荧光显微镜下观察、计数发绿色荧光细胞数， 每孔取５个视野，取其平均值计算转染效率，计算公式为:细胞转染率＝（绿色荧光细胞数／ 细胞总数）×１００％。０.１２５％胰蛋白酶消化成单细胞，Ｄ－Ｈａｎｋ 液漂洗，１５００ ｒ／ｍｉｎ 离心５ ｍｉｎ，重悬于ＰＢＳ液中，用流式细胞仪检测ＧＦＰ 阳性细胞的百分率。

    １.２.７  ＭＴＴ法检测细胞毒性  实验分组同细胞转染，增加不接种细胞的无血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ作为空白调零组，第７组作为对照组。将第３～第４代ＣＥＣ细胞按每孔１×１０４个细胞接种于９６孔板中，待细胞长满至８０％时转染。转染液的配制及转染步骤同上，９６孔板每孔转染液量为6孔板的１／５。转染４８ ｈ后，用微量注液器每孔加入５ ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ ２０ μｌ，孵育４ ｈ后将各孔的液体轻轻吸出，再加入二甲基亚砜１５０ μｌ。９６ 孔培养板在振荡器上振荡５ ｍｉｎ ，以空白调零组调零，用酶标仪测定４９５ nm波长上每孔的吸光度值。实验重复５次取平均值。

    １.２.８  ＲＴ－ＰＣＲ  ＲＴ采用说明书Ｍ－ＭＬＶ 逆转录酶标准体系， ３７℃反应６０ ｍｉｎ。其中ＥＧＦＰ 的上游引物序列为５＇－ＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＧＧＡＡＴＡＡ－３＇， 下游引物序列为５＇－ＡＧＴＴＧＣＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＡ－３＇， 扩增片段长度１８８ ｂｐ。ＧＡＰＤＨ设为内参照， 上游引物序列:５＇－ＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＡ－３＇，下游引物序列: ５＇－ＣＡＣＡＡＴＧＣＣＧＡＡＧＴＧＧＴＣＧＴ－３＇， 扩增片段长度２９３ ｂｐ 。ＰＣＲ 扩增采用５０ μｌ 反应体系，内含ｃＤＮＡ ４ μｌ，ＥＧＦＰ引物２０ ｐｍｏｌ，５ μｌ １０×ｂｕｆｆｅｒ，４ μｌ ２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，１ μｌ，１０ μｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，Ｔａｑ酶２.５ Ｕ。按下述条件进行循环: ＥＧＦＰ ９５℃６０ｓ， ５３℃ ３０ｓ，７２℃ ６０ｓ，３２ ｃｙｃｌｅｓ；扩增产物２％琼脂糖凝胶电泳，观察并记录结果。

    １.２.９  统计学方法  应用ＳＰＳＳ １３.０ 统计软件， 用?字２检验对比分析不同组间转染效率，ＭＴＴ比色法采用单因素方差分析进行统计学处理。

    ２  结果

    ２.１  不同转染液的转染效率  经不同转染液处理，兔角膜内皮细胞质粒ＤＮＡ 的转染效率（见图1）：在１～４组加ｐＥＧＦＰ－Ｎ１转染液（见转染液配制） 处理的细胞中均可检测到绿色荧光蛋白的表达。转染效率分别为：转染液?譹?訛组２２.４％，转染液?譺?訛组４２.６％，转染液?譻?訛组为７.２％，转染液?譼?訛组只有１％，其他各组转染液处理的细胞，结果均无绿色荧光蛋白表达。经统计学χ２ 检验可知，χ２＝８１.２３３，Ｐ＜０.０１，各组不同转染液的转染效率差异有显著性。氮酮加脂质体加ｐＥＧＦＰ－Ｎ１ 组转染效率最高。

 ２.２  ＭＴＴ法检测细胞毒性

    各组转染角膜内皮细胞后，细胞的生长形态正常。实验组与对照组间角膜内皮细胞活性差别无显著性（Ｐ﹥０.０５）（见表１）。

    ２.３  ＲＴ－ＰＣＲ  半定量ＲＴ－ＰＣＲ检测结果（见图２）显示， ｐＥＧＦＰ－Ｎ１组、质粒＋氮酮组未检测到ＥＧＦＰ表达，而质粒＋脂质体组和氮酮＋质粒＋脂质体组均检测到ＥＧＦＰ表达， 转染液?譺?訛组所得细胞的ＧＦＰ ｍＲＮＡ的条带明显亮于转染液?譹?訛组。

    ３  讨论

    角膜内皮细胞正常的密度和功能是维持角膜透明的关键，细胞生物学、分子生物学、病理学等各方面的研究表明成人的角膜内皮细胞在体内几乎没有增殖的能力［３，４］。当细胞密度低于８００个／ｍｍ２就会出现内皮功能失代偿，导致大泡性角膜病变。转基因技术的出现使得促进角膜内皮细胞增殖成为可能。

    基因转移根据所用的载体不同分为病毒和非病毒两类方法。阳离子脂质体属于非病毒介导的基因转染方法，其优点是毒性低、安全，它的缺点是转染效率较低，因此限制了其应用价值。

    氮酮的化学名称为：１－正十二烷基氮杂环庚烷酮－２，在低浓度时能极大增强不论是亲水性或是疏水性化合物的透皮作用。同时，由于氮酮对细胞壁和细胞膜的溶解作用，它还有对Ｇ＋菌及芽孢的抑菌作用［５］。目前虽然氮酮尚未在眼科领域做临床应用，但国内外已有动物实验研究初步证明一定浓度的氮酮对细胞无毒性作用［６~８］。张虹等［２］研究发现：０.１ ｇ/Ｌ氮酮使角膜内皮细胞超微结构发生改变——细胞膜表面产生暂时性裂隙，与电穿孔转染基因的作用机制相类似，由此推测氮酮有望用于基因转染的研究。

    本研究在将氮酮应用于基因转染实验之前，就不同氮酮浓度对角膜内皮细胞、小梁细胞以及晶状体上皮细胞增殖活性与形态结构的影响进行了大量的研究［２，７，９］。结果证实浓度０.１ ｇ/Ｌ以下氮酮对角膜内皮细胞形态和超微结构无影响，浓度０.１ ｇ/Ｌ以下氮酮直接作用于角膜内皮细胞在２４ ｈ内是安全的。随着氮酮浓度的升高，细胞形态及超微结构出现改变，在浓度０.５ ｇ/Ｌ以上可抑制细胞增殖，使细胞出现空泡样变性，甚至导致细胞死亡。

    根据以上研究，我们在转染实验中氮酮采用的浓度为０.１ ｇ/Ｌ，考虑到脂质体和氮酮对细胞活性均有一定影响，我们用ＭＴＴ法测定了各组转染液对角膜内皮细胞的毒性影响，结果显示：水溶性氮酮在浓度０.１ ｇ/L以下作用５ min而后按常规转染，与对照组及无氮酮转染液组相比较，４９０ ｎｍ下的ＯＤ值无统计学意义，说明一定浓度的氮酮和脂质体组成的联合转染试剂对角膜内皮细胞的生长无明显毒性。

    转染实验结果表明，以浓度为０.１ ｇ/Ｌ的氮酮处理角膜内皮细胞５ min后，清除氮酮，再加入脂质体包被的含绿色荧光蛋白基因的质粒ＤＮＡ，角膜内皮细胞不但可以表达绿色荧光蛋白，而且转染效率也有提高。原因可能是：当氮酮与角膜内皮细胞作用后，引起角膜内皮细胞胞膜的脂质层松动及开裂，有利于脂质体与胞膜的融合，从而促进外源基因ＤＮＡ进入细胞内，提高转染效率。由于氮酮在细胞表面产生的是瞬时裂孔，因此清除氮酮和加入脂质体／ＤＮＡ复合物之间的时间应尽量缩短。

    以上结论通过ＲＴ－ＰＣＲ半定量分析也得到了证实。氮酮联合脂质体及ｐＥＧＦＰ－Ｎ１组，脂质体联合ｐＥＧＦＰ－Ｎ１组中ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ 均有较高的表达，而在质粒组，以及质粒＋氮酮组中却未检测到其表达。这可能与转染入ＣＥＣ细胞的质粒量过少， 而导致提取的ＥＧＦＰｍＲＮＡ 含量偏少，而且在操作过程中很快降解有关

从上述的研究中我们认为，适当浓度的氮酮有促进脂质体介导质粒ＤＮＡ 转染的作用，且对细胞的活性无影响。 它对角膜内皮细胞的高效安全的转染提示在眼科的基因治疗中， 氮酮将有广泛的应用前景。