人Kringle1-5蛋白滴眼液抑制兔角膜新生血管的研究

　　作者：刘勇，王恩普，李 丹，刘 兵，耿 惠，孙永华

　　【摘要】 观察人Kringle1-5(K1-5)蛋白滴眼液来观察其抑制角膜新生血管的效果。方法：随机将缝线法诱导单侧角膜新生血管的28只新西兰白兔分为两组。K1-5组给予人K1-5蛋白滴眼液点眼，PBS组给予PBS液点眼。观察两组角膜新生血管形成时间、最长新生血管、新生血管面积并进行统计学分析。随机选择处死实验兔，取下角膜组织进行病理检查。结果：K1-5组最早于3d，平均3.50±0.52d可见新生血管芽进入角膜缘，9～15d新生血管生长最为旺盛;20d时最长新生血管为4.38±0.27mm，新生血管面积27.51±4.19mm2。而对照组最早于2d，平均2.28±0.47d可见新生血管芽进入角膜缘，4～10d时新生血管生长最为旺盛;至20d时新生血管最长为7.33±0.46mm，新生血管面积为38.96±4.11mm2。两组角膜新生血管出现时间、最长新生血管、新生血管面积方面均具有统计学差异(P <0.01)。在不同时段里K1-5组角膜基质层缝线周围新生血管较少，局部有少量浆细胞及成纤维细胞;PBS组新生血管较多，局部有较多浆细胞、淋巴细胞、成纤维细胞。K1-5组在不同时段里角膜组织中VEGF121阳性表达少于PBS组。 结论：人K1-5蛋白点眼能够抑制缝线法诱导的角膜新生血管形成和生长。

　　【关键词】 角膜新生血管

　　0 引言

　　角膜新生血管(corneal neovascularization)是常见的角膜疾病，可以由外伤、手术、感染、毒素、营养不良等诸多因素引起[1]。Kringle1-5(K1-5)蛋白作为纤溶酶原的降解产物，具有特异性抑制血管内皮生长作用，目前一些体内外试验已证实其能抑制新生血管的生长，但在局部点眼抑制角膜新生血管的报道较少[2]。

　　1材料和方法

　　1.1材料 健康成年的新西兰白兔28只，体质量2.2～3.4kg，雄性10只，雌性18只，均由空军总医院实验动物中心提供。裂隙灯下观察双眼结膜角膜正常。随机确定每只兔实验眼。氯胺酮10mg/kg+速眠新0.2mg/kg sc麻醉，麻醉生效后，实验眼2.5g/L氯霉素眼液清洁点眼，5g/L地卡因表面麻醉。放置开睑器后，于角膜缘内1.5mm处板层置5-0丝线3根，间距为1.5mm，缝线埋于角膜基质内5mm，角膜面留1mm线头。将角膜缝线处理过的新西兰白兔运用计算机随机数字法进行分组，分为K1-5组和PBS组，每组各14只。参考Cao等[2]实验结果并结合预实验结果，对于K1-5组的实验眼给予配好的1.5mg/L的K1-5蛋白滴眼液[配制方法为无菌条件下将150μg人K1-5蛋白(购于美国Alpha公司)溶于100mL PBS液中，并在4℃冰箱保存]，4次/d;PBS的实验眼给予PBS液。4次/d。28只兔同时给予2.5g/L氯霉素眼液点眼预防感染，4次/d。

　　1.2方法 每日裂隙灯观察角膜新生血管的长度，数目以及角膜水肿情况;并按照公式A =C/12×3.1416[r 2-(r -l)2] [3]计算新生血管面积(C为新生血管所占角膜圆周的钟点数，r为角膜半径，l为深入角膜中央的最长血管。术后1，3，5，7，10，13，15，17，20d对实验眼拍照。二组分别在缝线后5，10d随机各处死3只实验兔，取下角膜组织送病理;缝线后20d处死剩余实验兔，随机选择其中3只送病理。取上述实验兔角膜组织，立即用40g/L甲醛液固定，2wk后每一标本经石蜡包埋、编号。分别进行HE染色以及免疫组织化学染色。采用EliVisionTMplus免疫组织化学染色盒(中国福建迈新生物技术开发公司)进行染色。其中一抗为人抗鼠/兔VEGF121Ab-3(美国Labvision公司)，染色过程中加入内源性过氧化酶阻断剂，二抗为酶标羊抗鼠/兔聚合物(中国福建迈新生物技术开发公司)，DAB显色液，阳性显色为棕褐色;每次染色时均用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　统计学处理：对二组新生血管出现时间、不同时段角膜最长新生血管长度及新生血管面积进行统计分析，正态分布数据用x±s，并作二组独立样本均数t检验分析。所使用软件为SPSS12.0数据统计分析系统。

　　2结果

　　2.1角膜新生血管 制备角膜缝线后PBS组最早于2d，平均时间2.28±0.47d可见新生血管芽深入角膜缘，4～10d时生长最为旺盛，20d可以观察到最长新生血管为7.33±0.46mm，平均面积为38.96±4.11mm2。新生血管粗大、密集成堆，不易分辨;缝线周围角膜中度水肿。K1-5组角膜最早于3d，平均时间是3.50±0.52d可见新生血管芽进入角膜缘，9～15d新生血管生长最为旺盛，16～20d趋于缓慢，20d观察到新生血管较细、稀疏，缝线周围角膜轻度水肿(图1A，B)。两组角膜新生血管出现时间有统计学意义(F=16.00，P=0.000)。二组不同时段最长新生血管长度以及新生血管面积比较均有统计学意义(P<0.01，表1)。

　　2.2组织病理学 缝线后5，10及20d K1-5组角膜基质层缝线周围新生血管少，浆细胞及成纤维细胞较少，炎症反应较轻。PBS组角膜基质层新生血管多，管腔大，有大量浆细胞、淋巴细胞及成纤维细胞，炎性反应较重(图2A，B)。缝线后5，10及20d，在K1-5组角膜组织切片中可见以血管内皮细胞为主的细胞胞质内血管内皮生长因子(VEGF121)阳性表达较少;而PBS组角膜组织切片中VEGF121阳性表达较多(图3A，B)。

　　A K1-5组;B PBS组

　　图1 角膜缝线术20d×16

　　A K1-5组;B PBS组

　　图2 角膜缝线术20d HE×100

　　A:K1-5组;B:PBS组

　　图3 角膜缝线术20d VEGF121染色×200

　　3讨论

　　角膜在正常生理状态下是没有血管的，但是各种导致角膜缘屏障破坏的病因都可以诱导角膜新生血管化[1]。角膜新生血管化不仅是致盲的重要原因之一，亦是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素。新生血管化的植床既能增加术后的排斥反应率，又降低植片的存活率，并且新生血管的数量与术后排斥反应率呈正相关。因此采取有效措施抑制角膜新生血管的形成和生长，是减少角膜移植排斥的重要措施之一[4,5]。我们首先建立起兔角膜新生血管的模型。在以往研究中建立角膜新生血管模型的方法较多。常用的有酸碱化学烧灼法，这种方法取材简单、操作方便，可以良好地诱导出角膜新生血管，并且角膜新生血管的形成、生长情况确切;但存在有烧灼范围、烧灼深度等方面不易控制的问题[6]。另一种较为常用的方法是角膜微袋内植入化学颗粒来诱导新生血管，这种方法诱导出的新生血管生长定向性好，个体间差异性小;但存在使用的器械特殊、药物配制及包埋过程较为复杂等不利因素 [7]。我们采用角膜缝线法建立角膜新生血管模型。与以上两种方法比较，诱导的新生血管形成理想，且在形成时间、生长速度、生长方向等方面个体间差异小，易于比较，同时材料简单，操作容易[8]。在本实验研究中以PBS组结果作为模型的参照，此组诱导出的兔角膜新生血管与Holzer等[9]研究结果类似，且个体间差异性较小。因此本研究中对所建立的角膜新生血管模型评价是满意的。

　　由于目前研究已证实角膜新生血管形成步骤与其他部位新生血管的形成是类似的，都表现为血管基底膜的降解、内皮细胞增殖致新生血管芽的形成、分支，新生血管腔的形成，直至血管成熟细胞的形成，所以针对抑制新生血管生成的研究也是作用于不同阶段。近年来研究发现纤溶酶原的降解片段具有强大的抑制新生血管形成作用，其最早是由O’Reilly等从Lewis肺癌小鼠的尿、血清中分离得到，而K1-5蛋白作为纤溶酶原的一个55ku降解片段，包含着纤溶酶原完整的K1-4和大部分K5片断[10]。同时有研究发现K1-5可特异地抑制处于增殖状态的血管内皮细胞并诱导内皮细胞的凋亡，来发挥强大的抑制新生血管的作用，并且发现其不影响静止的内皮细胞或非内皮起源的细胞[10,11]。也有研究认为K1-5还可通过干预整合素αvβ3介导的信号传导来抑制新生血管生成[12]。我们将人的K1-5蛋白配制成1.5mg/L眼液应用于缝线法诱导的兔角膜新生血管模型中，结果发现，K1-5组角膜新生血管出现时间晚于PBS组(二者之差为1.40±0.31d);K1-5组角膜新生血管生长高峰在9～15d，而PBS组则在4～10d;在整个新生血管生长过程中K1-5组的新生血管长度、面积均明显小于PBS组。由以上结果可以得出局部使用K1-5滴眼液可通过延缓角膜新生血管的形成时间及其生长高峰，并减小新生血管长度、面积来发挥其抑制角膜新生血管的作用。这一结果与Cao等[2]使用2～2.5mg/L K1-5的抑制角膜新生血管效果基本一致。由此可证实局部使用1.5mg/L K1-5蛋白能够抑制兔角膜新生血管的形成、生长。我们分别在不同时段(5，10，20d)对角膜组织进行HE染色，可以观察到各个时段里K1-5组角膜组织中缝线及新生血管周围各种炎症细胞(主要为浆细胞、淋巴细胞等)较少，其炎症反应较轻;而PBS组炎症细胞较多，其炎症反应较重。据此可推测出K1-5具有抑制角膜局部炎症反应的效果，而这一结果在以往文献中较少报道[11,13]。由此可提示我们K1-5亦可能是一种抗炎剂或在一定程度上能够抑制炎症反应，通过减轻由物理因素引起的局部炎症反应，减少相关炎症因子的表达，也就减弱了相应新生血管刺激性因素的作用，从而发挥出抑制新生血管的功能。但也不能排除是因为K1-5抑制了角膜新生血管的形成、生长，减少了来自新生血管中各种炎症细胞的聚集，所以在局部就表现为相对轻的炎症反应。由于本实验研究的限制，对于K1-5究竟有无抗炎功能及其可能的作用机制还需要进一步研究来明确。

　　现有研究已发现，在新生血管的形成过程有两大类因子共同发挥调控作用：一些细胞因子具有促进作用，如VEGF、bFGF等;另一些则是抗血管生成因子，如angiostatin，endostatin等[14,15]。在促新生血管因子中，血管内皮生长因子(VEGF)的作用已得到明确证实，首次是由Senger等在1983年分离出，目前研究已发现VEGF实际上是一类34～45ku糖蛋白二聚合物，其中高剂量的VEGF121能显著地增加新生血管的直径，这一过程可能是通过 MEK1-ERK1/2 信号来进行的，进而引起内皮细胞的增殖及迁移[16]。我们运用VEGF121进行免疫组织化学染色，结果发现在不同时段里，K1-5组角膜新生血管内皮细胞中VEGF121的阳性表达均明显少于PBS组，同时发现两组中VEGF121阳性表达强度均是与角膜新生血管长度、面积的变化一致。其中PBS组VEGF 121阳性表达情况与Nakatsu等[17]以及Castro等[18]研究结果相近。根据本研究结果结合目前对K1-5作用机制的研究，推测出K1-5可能是通过诱导血管内皮细胞的调亡，干预整合素αvβ3介导的信号传导来抑制血管内皮细胞的各种活性功能，从而使VEGF的表达受到抑制，同时也减弱了VEGF与新生血管内皮细胞相应受体的结合，使得VEGF难以发挥出其强大的诱导新生血管作用，结果表现为角膜新生血管的形成及生长受到抑制。

　　此外，我们还观察到K1-5组角膜新生血管未能受到完全抑制，分析其原因可能为：①K1-5蛋白配成眼液后，本身存在有蛋白质自身代谢问题，随着药物的自身代谢，其强大的作用效果就会受到影响。②已往研究资料中K1-5 在体外实验结果是理想的，眼结膜下注射也有较好效果，但局部点眼报道较少，因此K1-5眼液的前房渗透力尚不能明确。③由于研究已证实新生血管的形成涉及诸多因素步骤，因此采取单一措施往往只能在一定程度上抑制新生血管的形成和生长，并不能完全抑制新生血管。④我们采用人的K1-5蛋白，应用于兔是否可能存在种属之间的差异性尚不清楚，由此也可能影响其在研究中的抑制效果。

　　总之，人K1-5 蛋白滴眼液作为一种新型的新生血管抑制因子是能够抑制兔角膜新生血管的形成及生长，并能在一定程度上减弱局部炎症反应。研究结果能够提示我们K1-5蛋白滴眼液在抑制角膜新生血管方面是有着较好的应用前景，但由于本实验研究存在的局限性，因此对K1-5蛋白抑制角膜新生血管的作用途径、作用效果以及毒副反应等方面仍需要进一步深入研究加以证实。

　　【参考文献】

　　1 Chang JH, Gabison EE, Kato T, Azar DT. Corneal neovascularization. Curr Opin Ophthalmol ,2001;12(4):242-249

　　2 Cao R, Wu HL, Veitonmaki N, Linden P, Farnebo J, Shi GY, Cao Y. Suppression of angiogenesis and tumor growth by the inhibitor K1-5 generated by plasmin-mediated proteolysis. Proc Natl Acad Sci USA ,1999;96(10): 5728-5733

　　3 Pan X, Wang Y, Zhang M, Pan W, Qi ZT, Cao GW. Effects of endostatin-vascular endothelial growth inhibitor chimeric recombinant adenoviruses on antiangiogenesis. World J Gastroenterol ,2004;10(10):1409 - 1414

　　4 Hill JC. High risk corneal grafting. Br J Ophthalmol ,2002;86:945

　　5 Holzer MP, Solomon KD, Vroman DT, Sandoval HP, Margaron P, Kasper TJ, Crosson CE. Photodynamic therapy with verteporfin in a rabbit model of corneal neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2003;44(7):2954-2958

　　6 Zhang H, Li C, Baciu PC. Expression of integrins and MMPs during alkaline-burn-induced corneal angiogenesis. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2002;43(4):955-962

　　7 Wu PC, Yang LC, Kuo HK, Huang CC, Tsai CL, Lin PR, Wu PC, Shin SJ, Tai MH. Inhibition of corneal angiogenesis by local application of vasostatin. Mol Vis ,2005;11:28-35

　　8 Tang WQ, Liu L, Li J, Wen XF. Corneal neovascular model construction in rats induced by corneal stitch. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi) ,2004;4(5):820-823

　　9 Holzer MP, Solomon KD, Vroman DT, Sandoval HP, Margaron P, Kaspe T Jr, Crosson CE. Photodynamic therapy with verteporfin in a rabbit model of corneal neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2003;44(7):2954-2958

　　10 Sumariwalla PF, Cao Y, Wu HL, Feldmann M, Paleolog EM. The angiogenesis inhibitor protease-activated kringles 1-5 reduces the severity of murine collagen-induced arthritis. Arthritis Res Ther ,2003;5(1):32-39

　　11 Zhou QW, Xie JL, Xin L, Ye Q, Li ZP, Gan RB. Expression and characterization of Kringle 1-5 domains of human plasminogen. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai) ,2003;35(8)761-767

　　12 Tarui T, Miles LA, Takada Y. Specific interaction of angiostatin with integrin alpha(v)beta(3) in endothelial cells. J Biol Chem ,2001;276(43):39562-39568

　　13 Veitonmaki N, Cao R, Wu LH, Moser TL, Li B, Pizzo SV, Zhivotovsky B, Cao Y. Endothelial cell surface ATP synthase-triggered caspase-apoptotic pathway is essential for k1-5-induced antiangiogenesis. Cancer Res ,2004;64(10):3679-3686

　　14 Kerbel RS. Vasohibin: the feedback on a new inhibitor of angiogenesis. J Clin Invest ,2004;114(7):884-886

　　15 Scharovsky OG, Binda MM, Rozados VR, Bhagat S, Cher ML, Bonfil RD. Angiogenic and antiangiogenic balance regulates concomitant antitumoral resistance. Clin Exp Metastasis ,2004;21(2):177-183

　　16 Schlingemann RO, van Hinsbergh VW. Role of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor in eye disease. Br J Ophthalmol ,1997;81(6):501-512

　　17 Nakatsu MN, Sainson RC, Perez-del-Pulgar S, Aoto JN, Aitkenhead M, Taylor KL, Carpenter PM, Hughes CC.VEGF(121) and VEGF(165) regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model. Lab Invest ,2003;83(12):1873-1885

　　18 Castro MR, Lutz D, Edelman JL. Effect of COX inhibitors on VEGF-induced retinal vascular leakage and experimental corneal and choroidal neovascularization. Exp Eye Res ,2004;799(2):275-285