脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜Müller细胞的比较

　　作者：曾琦，夏晓波 作者单位：410008)中国湖南省长沙市，中南大学湘雅医院眼科

　　【摘要】 目的：探讨脂质体法及电穿孔法介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养的视网膜Müller细胞的可行性和区别。方法：体外培养出生后7～10d的SD大鼠视网膜Müller细胞，免疫荧光染色法鉴定95%以上为视网膜Müller细胞。分别用阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导的脂质体转染法和电穿孔法将质粒PEGFPN1转染视网膜Müller细胞,荧光显微镜下检测转染后1，2，3，4d的转染效率，并持续观察至转染后14d，比较两者基因表达持续时间。结果：荧光显微镜下检测转染后1d，两组均可见少量细胞表达EGFP绿色荧光蛋白。转染后2d，两者转染效率均达到最大，并且电穿孔法介导质粒PEGFPN1转染Müller细胞效率约为31.0%±2.8%,较脂质体法转染效率(10.5%±2.4%)更高。两者比较有统计学意义(P<0.01)。随后，两者转染效率均逐渐降低。电穿孔转染后的PEGFPN1可在视网膜Müller细胞内持续表达近14d，而脂质体转染后仅能表达约7d。结论：脂质体法和电穿孔法均适用于视网膜Müller细胞的基因转染，但电穿孔法效率更高，表达时间更长。

　　【关键词】 脂转染;电穿孔;基因转染;视网膜Müller细胞;增强型绿色荧光蛋白基因

　　Comparison of electroporation and lipofection efficiency in retinal Müller cellsQi Zeng, XiaoBo Xiaepartment of Ophthalmology, Xiangya Hospital,Central South University,Changsha 410008,Hunan Province, China　AbstractAIM:To evaluate the possibility of transferring enhanced green fluorescent protein (EGFP) to cultured retinal Müller cells (RMCs) via electroporation and lipofection and to compare the transfection efficiency of electroporation with lipofection in cultured RMCs of rats.METHODS: First of all, Müller cells were isolated from rat retina,and proliferating cells were expanded in serumcontaining medium.Secondly,the third or fourth passage of cells were identified by glutamatespartate transporters (GLAST) and glutamine synthetase (GS). Thirdly,cultured RMCs were transfected either by electroporation or by lipofection using a PEGFPN1 plasmid. At last,the cells were analyzed 24,48 hours, 3,4 days,1 week and 2 weeks after transfection by fluorescence microscopy.RESULTS: Ninetyfive percent cultured RMCs were positively reacted for GLAST and GS. Twentyfour hours after transfection there are only few cells transfected in these two groups. However,the percentage of transfected cells was significantly higher when electroporation was used as compared with lipofection in fortyeight hours after transfection. At this time,the transfection efficiency was superior with electroporation (31.0%±2.8%) as compared to lipofection (10.5%±2.4%). And there were significant differences between them (P<0.01).The expression of EGFP could be detected for at most 1 week after lipofection and more than 2 weeks after electroporation.CONCLUSION: Our results show the feasibility of a gene tranfer into RMCs via electroporation and lipofection. Electroporation is superior to lipofection in RMCs. This study may provide a novel tool for our future targeted gene therapy on RMCs.

　　KEYWORDS: lipofection; electroporation;gene transfection; retinal Müller cells; enhanced green fluorescent protein

　　0　引言

　　Müller细胞是人和哺乳动物视网膜中最主要的神经胶质细胞,该细胞从内界膜一直延伸到外界膜,贯穿于整个视网膜,其突起广泛分布于视网膜内各类神经元胞体和纤维之间，与各神经元密切接触，正是这种与视神经元细胞之间的广泛联系使得其在维持视网膜神经元正常功能和各种视网膜病理变化中发挥着重要的作用[1]。基因治疗是近年来兴起的一种治疗方法,过去在各种肿瘤和基因缺陷病的研究中应用广泛，而目前以Müller细胞为载体进行的基因治疗也已开始起步。我们用脂质体和电穿孔两种方法分别将真核表达质粒PEGFPN1转染视网膜Müller细胞,荧光显微镜下检测瞬时转染效率,比较两种方法转染效率的区别,以寻找更为高效的Müller细胞转染方法，为Müller细胞为载体的基因治疗奠定基础。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　DMEM(美国GIBCO公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、胰酶、多聚赖氨酸和4,6二脒基2苯基吲哚(4,6diamidino2phenylindole，DAPI)(美国Sigma公司)、兔抗鼠谷氨酸转运体GLAST多克隆抗体和兔抗鼠谷氨酰胺合成酶GS多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)、兔抗Cy3荧光单抗(美国KPL公司)、PEGFPN1真核细胞表达质粒(美国Clontech公司)、脂质体Lipofectamine 2000和OptiMEM(美国Invitrogen公司)、0.4cm电转杯(美国Biosmith公司)、CO2培养箱(美国Thermo Forma公司)、Axiovert 2000倒置荧光显微镜(德国ZEISS公司)、ELWD 0.3倒置显微镜(日本Nikon公司)、Gene PulserⅡ电穿孔仪(美国BioRad公司)。取出生后7～10d的新生SD大鼠(中南大学实验动物学部提供)视网膜组织，参照文献[2,3]方法进行Müller细胞的培养。取第3～4代Müller细胞，胰酶消化后以1×105/L的密度接种于预置有盖玻片(0.1g/L多聚赖氨酸包被)的24孔板中，待Müller细胞融合达80%～90%时行免疫荧光染色进行细胞鉴定。步骤：吸出24孔板中各孔内培基，加入37g/L多聚甲醛，静置15min，1g/L TritonX 100，渗透10min，50g/L BSA封闭30min，50g/L BSA稀释的一抗(GS或GLAST)孵育1h，PBS漂洗5次，50g/L BSA再封闭20min，50g/L BSA稀释的二抗孵育1h，PBS漂洗7次，各孔加入终浓度为1mg/L DAPI，1min后PBS漂洗2次，一蒸水漂洗1次，甘油封片。磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。组织块法培养24～48h后见有细胞从组织块边缘爬出，以后逐渐增大呈多角形、星形或梭形，胞质丰富，胞膜清楚，胞核呈椭圆形,多位于细胞中央，7～10d后细胞基本融合成细胞单层，呈镶嵌样排列。以后每2～3d换液1次，每5～7d按1∶2传代1次。传至7～8代后细胞逐渐衰老。取第3～4代的视网膜Müller细胞行免疫荧光染色鉴定，95%以上细胞谷氨酸转运体GLAST抗体和谷氨酰胺合成酶GS抗体染色阳性，显示红色荧光。

　　1.2　方法

　　1.2.1　脂质体转染

　　转染前24h, 24孔板中接种视网膜Müller细胞，调整细胞密度至1×105/孔。吸出各孔内培基，无血清DMEM培养基漂洗1次，各孔内加入OptiMEM 200μL。在新的1.5mL EP管中准备溶液A、溶液B。A液: OptiMEM 50μL+ PEGFPN1质粒2μg，室温下静置5min，B液:OptiMEM 50μL +脂质体Lipofectamine 20004μL，室温下静置5min。将A，B两种液体混合，室温下再静置20min后加入24孔板中,轻轻摇晃使之与细胞均匀接触。37℃ 50mL/L CO2培养箱培养2～3h后，弃去原培养液，改由含200mL/L胎牛血清的完全培养基继续培养，每2～3d换液1次。转染后1，1.5，2，3，4，7，14d后倒置荧光显微镜下观察,取10个不同视野分别计数表达增强型绿色荧光蛋白的细胞和总细胞数,计算转染效率。转染效率(%)=荧光显微镜下有荧光表达细胞数/总细胞数×100%。

　　1.2.2　电穿孔法转染

　　取生长良好的视网膜Müller细胞转染,吸尽培养液，胰酶消化3min，含200mL/L胎牛血清的DMEM培养基终止消化，吹打悬浮细胞，调整细胞密度至2.0×106/700μL，吸出细胞悬液移入1.5mL EP管，室温下1000r/min离心5min，弃上清，加入电转缓冲液(PBS 200mL中含272mmol/L蔗糖、10mmol/L K2HPO4，1mmol/L Mgcl2，PH=7.4)重悬细胞。以3.5×1010个细胞/g质粒的浓度，将细胞悬液及PEGFPN1质粒加入4mm电转杯中,混合均匀，冰浴5～10min。将电转杯放入电转槽，电转仪电击，参照Webster等[4]的方法设置转染条件:电压450V,电容500μF。操作完毕后,将电转杯取出，再次冰浴5～10min,小心将细胞转移到24孔培养板中,每孔加入含200mL/L胎牛血清的完全培养基1mL,置于37℃ 50mL/L CO2培养箱中继续培养。24h后换液1次，之后每2～3d换液1次。于不同时间点观察细胞并计算转染效率。

　　统计学分析：采用SPSS12.0统计学软件对数据进行统计学分析,计量资料所有数据均以±s表示。脂质体转染组和电穿孔转染组转染效率的比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　脂质体转染

　　增强型绿色荧光蛋白( enhanced green fluorescent protein, EGFP)为报告基因，荧光显微镜下转染成功的细胞胞质或胞核内即可见到强度均匀的绿色荧光。阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导转染24h后,荧光显微镜下观察可见部分细胞变圆漂浮死亡，贴壁细胞中有部分细胞质内可见散在荧光表达，强度较弱。之后变圆死亡的细胞数无明显变化，阳性细胞数及细胞内荧光强度均显著增强，48h时达到最大，可见细胞质内呈强阳性表达，此时转染效率约为10.5%±2.4%(图1A，B)。随着转染时间的延长，荧光表达细胞数逐渐减少，转染成功细胞内荧光强度逐渐减弱，至转染后7d仅有极少许散在弱荧光存在。

　　2.2　电穿孔法转染

　　转染1d后即可见大部分细胞已贴壁，少部分细胞仍呈圆形或细胞死亡,核固缩呈黑色。倒置荧光显微镜下见极少量细胞发出绿色荧光。2d时贴壁细胞已基本伸展成多角形、星形、梭形，同正常视网膜Müller细胞形态，表达绿色荧光蛋白基因( EGFP)阳性细胞数增多,强度增强,绿色荧光多分布在细胞质内,胞质内荧光强度均匀明亮 (图2A，B)。此时转染效率最高，约为31.0%±2.8%，明显高于脂质体转染组(t=8.08，P<0.01)。转染3～4d后，视网膜Müller细胞仍继续表达EGFP，且荧光表达量及强度变化不大。7d后,表达绿色荧光的细胞数减少,荧光强度减弱。到14d时,仍可见少量散在的荧光表达。

　　3　讨论

　　基因转染正逐渐成为各种人类疾病病因研究和临床治疗中重要的手段与策略。许多研究者一直都在致力于寻找效率更高而毒性更低的基因转染靶细胞的方法。Müller细胞是视网膜的主要神经胶质细胞,具有维持视网膜正常结构、营养视网膜神经元、参与调节神经突触传递、构成血视网膜屏障等多种生理功能。此外，许多研究还表明Müller细胞在例如青光眼、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜脱离、增生性糖尿病视网膜病变等缺氧缺血性视网膜病变的发生发展中起重要作用, 包括可分泌多种生长因子, 影响视网膜的代谢状况, 参与视网膜神经细胞的损伤过程等[1]。由于Müller细胞在视网膜的病理、生理过程中的特殊作用,Müller细胞正逐渐成为眼科病因研究及治疗领域的重要靶细胞。而有关Müller细胞作为靶细胞进行的基因转染及比较研究还为之甚少。我们首先选择经典的Müller细胞培养方法进行细胞培养，结果发现培养的细胞均具有Müller细胞的一般形态。谷氨酸转运体GLAST和谷氨酰胺合成酶GS均是视网膜Müller细胞公认的细胞标记物。通过对培养的细胞进行以上两种抗体的免疫荧光染色，结果可以证实我们培养的视网膜Müller细胞纯度可达95%以上。目前将外源基因导入真核细胞的方法有很多种,大体可分为两大类:病毒转染法和非病毒转染法。病毒转染法具有很高的转染效率,但其存在安全和技术方面的缺点，例如携带的基因长度有限、可能引起错误的免疫应答与毒性反应、可能影响转染细胞的增殖与分化，具有潜在的致癌性等，从而限制了病毒转染法在基因治疗方面的广泛应用[5,6]。而非病毒转染法被认为是更安全和更适合于临床应用的转染方法，主要包括磷酸钙沉淀法、DEAE葡萄糖法、脂质体转染法和电穿孔法等。我们选择采用由Lipofectamine 2000介导的脂质体转染法和电穿孔转染法分别将PEGFPN1质粒转染入视网膜Müller细胞。脂质体法是一种化学方法，主要是通过阳离子脂质体试剂与靶DNA的磷酸骨架结合生成复合物而通过细胞膜的，由于细胞内屏障作用往往脂质体法转染效率并不高[7];而电穿孔法则是利用脉冲电场在细胞膜上形成孔洞,从而使外源基因进入细胞的一种物理方法。大量对哺乳动物细胞的体外基因转移实验均显示电穿孔法较脂质体转染法具有更高效的转染效率[8]。我们的实验也同样证明，脂质体和电穿孔法均能使PEGFPN1质粒进入Müller细胞,之后利用Müller细胞中转录及翻译所需的酶表达EGFP。随着进入Müller细胞内的PEGFPN1质粒数量逐步增多,细胞内EGFP的表达逐渐增多,于转染后48h出现EGFP表达高峰。此时电穿孔法转染效率明显高于脂质体转染法，约为后者的3倍。随后EGFP表达量逐渐下降，至转染后7d，脂质体法转染组仅见极少量EGFP荧光表达而电穿孔组荧光表达可一直持续到转染后2wk以上，其可能原因为DNA/脂质体复合物对细胞有毒性作用，当进入细胞内的DNA量增加以及DNA/脂质体复合物作用时间延长时,细胞毒性也逐渐加重, 细胞存活率下降, 细胞转染率随之下降[9]。我们是参照Webster等[4]电转大脑小胶质细胞的方法来进行Müller细胞电穿孔转染的，如后期再优化转染参数和方法，将可能得到更高的转染效率。另外，我们的实验还发现转染24h后,两组Müller细胞均有一部分变圆漂浮死亡，说明两种转染方法均具有一定的细胞毒性作用，而对两者细胞存活率及细胞功能改变等的比较还有待我们的进一步研究。

　　目前有关电穿孔法介导基因转染视网膜Müller细胞的研究还鲜有报道，而我们通过实验证明脂质体法和电穿孔法均能有效的将外源性DNA转移入视网膜Müller细胞内，并且电穿孔法较脂质体法的转染效率更强、基因表达时间更长。这将可能为未来开展的视网膜Müller细胞基因转染研究和基因治疗临床应用提供更好更新的手段。

　　【参考文献】

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　　4　Webster SD, Park M, Fonseca MI, et al. Structural and functional evidence for microglial expression of C1qR(P),the C1q receptor that enhances phagocytosis. J Leukoc Biol 2000;67(1):109116

　　5　Yang Y, Nunes FA, Berencsi K, et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1deleted adenoviruses for gene therapy. Proc Natl Acad

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　　6　Imai E, Akaqi Y, Isaka Y. Towards gene therapy for retinal diseases. Nephrologie 1998;19(7):397402

　　7　Ma H, Liu Q, Diamond SL, et al. Mouse embryonic stem cells efficiently lipofected with nuclear localization peptide result in a high yield of chimeric mice and retain germline transmission potency. Methods 2004;33(2):113120

　　8　Micka B, Trojaneck B, Niemitz S, et al. Comparison of nonviral transfection methods in melanoma cell primary cultures. Cytokine 2000;12(6):828833

　　9　钱锋，肖成组.脂质体法和电穿孔法转染哺乳动物细胞研究.生物化学与生物物理进展1999;26(3)：289291