补肾活血中药对慢性高眼压模型大鼠视功能损害的干预作用

　　作者：毛欣，李翔 作者单位：102300)中国北京市门头沟区中医医院眼科;(610072)中国四川省成都市，成都中医药大学附属医院眼科

　　【摘要】 目的：探讨补肾活血中药对大鼠慢性高眼压(elevated intraocular pressure，EIOP)模型视功能损害的干预作用和机制。方法：采用烙闭上巩膜静脉法，制作大鼠EIOP模型，随机分为5组：模型对照组，补肾活血高、中、低剂量组，空白对照组。连续灌胃8wk末处死大鼠，观察其对EIOP大鼠眼压(intraocular pressure，IOP)，多焦视网膜电图(multifocal electroretinogram，mfERG)和视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)病理形态学变化的影响。结果：造模后大鼠IOP明显升高，在造模后8wk IOP为造模前的3倍，补肾活血有轻度的降眼压的作用;对大鼠mfERG一阶函数核(first order kernel，FOK)的总波及1，2，3，4环P1波反应密度、总波P1波峰潜时、2环及3环N1波反应密度，3环、4环N1波峰潜时有恢复。结论：补肾活血中药可改善大鼠慢性EIOP模型的视功能，有助于mfERG反应密度和波峰潜时的恢复。

　　【关键词】 补肾活血中药;慢性高眼压大鼠模型;mfERG;视网膜神经节细胞

　　Effects of bushenhuoxue on protecting the visual function of rat with chronic intraocular hypertensionXin Mao, Xiang LiDepartment of Ophthalmology, Traditional Chinese Medicine Hospital of Mentougou District,Beijing 102300,China;Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Chengdu Traditional Chinese Medicine University, Chengdu 610072, Sichuan Province, China AbstractAIM:To observe the effect of traditional Chinese medicine(TCM) of bushenhuoxue on the rat model of chronic, moderately elevated intraocular pressure(EIOP).METHODS: By unilaterally cauterizing episcleral vessels, the rat model of chronic, moderately EIOP was gotten. 52 rats were divided into 5 groups randomly：model control group, treatment groups with high, middle, low dosage of bushenhuoxue of TCM, and normal control group.After given drugs or normal saline for 8 weeks, the rats were put to death and eyeballs were taken out. The effects were observed by intraocular pressure(IOP), multifocal electroretinogram(mfERG), and retinal ganglion cells(RGCs).RESULTS: Elevated IOP was gotten and there was an approximately 3fold increase in IOP for 8 weeks later comparing to premodels building. Bushenhuoxue of TCM can lower IOP slightly; To observe the mfERG first order kernel(FOK), bushenhuoxue of TCM can improve P1 waves 1, 2 ,3, 4 rings amplitude density , P1 wave’s peak time, N1 waves 2, 3 rings amplitude density and N1 waves 2,3 ring’s peak time.CONCLUSION: Bushenhuoxue of TCM can protect the visual function from elevating IOP by improving mfERGs amplitude density and peak time.So the mfERG can be a sensitivity method to evaluate its efficacy.

　　

　　KEYWORDS: bushenhuoxue;rat model of chronic intraocular hypertension; multifocal electroretinogram; retinal ganglion cell

　　0　引言

　　青光眼(glaucoma)是一类以特异性视神经萎缩和视野缺损为共同特征的眼病，病理性高眼压(intraocular pressure,IOP)升高是其主要危险因素之一。青光眼是一个多因素的不可逆性疾病，目前认为，青光眼的视功能损伤主要由于慢性高眼压(elevated intraocular pressure,EIOP)或低血流灌注压导致缺血、缺氧等，使视神经纤维轴浆流中断，从而引起青光眼视神经损害[1]。在眼部只要IOP与视乳头血供的平衡被打破，超出视网膜血液循环自动调节能力即能造成RNFL损害，表现出青光眼性视功能损害[2]。EIOP是青光眼视功能损害的基本因素，但并不是唯一因素，即使药物和手术有效的控制IOP，其视功能的损害仍会缓慢的发展。因此，除降低IOP以外，人们越来越关注改善视乳头血流灌注和加强视神经保护的治疗，为青光眼开辟一条新的治疗途径。且现代药理学研究证实，许多中药具有改善微循环，抗血栓，降低血液粘滞度，提高机体抗氧化能力，清除自由基，减轻缺血再灌注损伤等多方面的药理作用。因此，从中医药中发掘青光眼视功能保护的药物将越来越受到医学界的重视。我们采用烙闭上巩膜静脉法诱导产生IOP维持稳定、持续时间较长的慢性EIOP动物模型,选取杞菊地黄丸和复方丹参片作为干预药物，通过IOP，mfERG及RGSs超微结构的改变等客观指标观察补肾活血法对慢性EIOP大鼠模型视功能损害的干预作用，探讨补肾活血法对青光眼视功能的保护作用。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　清洁级SpragueDawley(SD)大鼠60只，雌雄各半，8～12周龄，体质量160～200g。饲养室温20℃～25℃，空气流通，相对湿度55%～75%，12h光照维持，昼夜循环。自由摄食饮水。纳入标准：无外眼疾病;双眼瞳孔对光反射正常;无歪颈。

　　1.2　方法

　　动物购回后，适应性喂养3d，连续测量3d IOP，进行正常IOP区间估计，取平均IOP在9～18mmHg者，以SPSS统计软件产生随机数字，随机分为5组，空白组不做处理，其余4组采用烙闭上巩膜静脉法进行单眼(右眼)造模，造模后成模动物随机分为模型组，补肾活血高、中、低剂量(相当于20倍、10倍、5倍成人剂量的复方丹参片和杞菊地黄丸的混悬液)组。因为灌胃等原因动物死亡8只。模型组、空白组分别予生理盐水，每天同一时间灌胃1次，连续灌胃8wk。每2wk称体1次，调整给药量。选用tonopen笔试眼压计测量IOP，在每天的同一时间进行，连续测量术前3d IOP，取平均值作为正常IOP;术后即刻、术后3d、术后每7d各测1次IOP，共8wk。mfERG检测采用德国Roland公司生产的RETIscan 3.15多焦电生理系统。于造模后8wk，进行mfERG检测。刺激方法参照Ball及Nusinowitz法[3,4]，所有mfERG反应曲线均以第1个大的正波和负波为分析对象。采用常规分析参数进行分析。数值以各波反应密度(即单位面积的振幅Nv/deg2)及各波峰潜时(ms)表示。各组随机选取1眼，透射电镜下观察RGCs形态、胞膜、核、细胞器等。

　　统计学分析：用SPSS 13.0 for Windows软件进行统计分析，计量资料均采用单因素方差分析，两两比较采用NewmanKeuls法q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　大鼠IOP

　　造模前各组大鼠IOP经统计学处理均无统计学意义;造模后即刻用药前，模型组及各用药组IOP与空白组比较及造模前比较有统计学意义(P<0.01);模型组与各用药组间比较无统计学意义;用药后8wk，模型组与各用药组间IOP比较无统计学意义;模型组IOP与造模后、用药前比较无统计学意义;用药后8wk，各用药组间IOP比较无统计学意义;用药后8wk，空白组与高剂量组IOP比较无统计学意义;空白组与中剂量组及低剂量组眼压比较有统计学意义(P<0.01)。表明烙闭上巩膜静脉法可以建立IOP维持稳定、持续时间较长的慢性EIOP动物模型,补肾活血中药有轻度的降IOP的作用(表1)。表1 大鼠眼压和mfERG比较(略)

　　2.2　大鼠mfERG

　　补肾活血可以部分改善大鼠慢性EIOP模型的视功能。通过对大鼠mfERG一阶函数核(first order kernel，FOK)的观察发现，补肾活血中药有助于总波及1，2，3，4环P1波反应密度、总波P1波峰潜时、2环及3环N1波反应密度，3环、4环N1波峰潜时的恢复。

　　2.3　大鼠RGC超微结构

　　透射电镜下，空白组轴突(axon)排列均匀、紧密，微丝、微管和线粒体(Mi)等成分可见。神经节细胞核(N)呈圆形或卵圆形，双层核膜清晰可见，核内充满均匀、色浅淡的常染色质，其间有少许靠近核膜、色稍深的异染色质，胞质中细胞器丰富，线粒体及其脊、内质网(ER)等形态正常，清晰可见。模型组轴突稀疏，有较多空白区域。神经节细胞核内染色质变成细小颗粒，胞质空泡化，仅存有少量线粒体高度膨胀，破裂，脊消失，内质网扩张呈空泡状。高剂量组轴突轻度水肿，排列较均匀，结构稍疏松。部分神经节细胞核内染色质轻度聚集，胞质中细胞器略减少，线粒体轻度肿胀，部分内质网扩张。中剂量组轴突水肿，排列疏松，微丝、微管和线粒体等成分减少。神经节细胞核内染色质聚集，胞质中细胞器减少，部分线粒体肿胀，部分脊消失。低剂量组轴突数量减少，部分空泡化，大部分神经节细胞核内染色质聚集较明显，核膜不清，胞质中细胞器减少，大部分线粒体肿胀明显，大部分脊消失，内质网明显扩张(图1A～D)。

　　3　讨论

　　目前，关于青光眼视神经损害的确切机制尚不十分清楚，可能有多种机制参与青光眼性视神经损伤，无论何种机制，其最终的结局均是视网膜神经节细胞的凋亡[5]。视网膜神经节细胞是视觉器官的第3神经元，其树突在内丛状层,轴突进入RNFL，构成视神经，与外侧膝状体核的神经元形成突触联系，将视觉信息传入中枢神经系统。青光眼导致视功能损害的病理基础主要是RGC坏死和视神经纤维(optic nerve fibre ,ONF)丧失。青光眼类似中医“五风内障”及“青盲”，属瞳神疾病，在五轮学说中，瞳神属水轮，内应于肾，近代名家陈达夫教授 “内眼结构与六经相属学说”认为，视神经、视网膜属足厥阴肝经，肝肾同源，故本病与肝肾关系密切。 “五风内障”多由风、火、痰、虚、郁等上犯目窍，导致气血失和，经络不利，气滞血瘀，目中玄府闭塞，神水瘀积为病，病久则肝肾两亏，神光衰微甚至泯灭、不睹三光而成“青盲”，故肝肾虚损、瘀血内停是青光眼视神经病理改变的主要病机，滋养肝肾，活血化瘀为防治青光眼视神经损害的基本方法。我们方选杞菊地黄丸和复方丹参片作为研究药物，滋补肝肾、活血化瘀。杞菊地黄丸为经典古方，为滋补肝肾明目的代表方剂，复方丹参片活血化瘀，两者均为《中国药典》载入药品、非处方用药，经济实用，服用方便。杞菊地黄丸和复方丹参片中，多味中药的现代药理研究证明均具有改善微循环，增加眼血流量,改善轴浆流，增强视网膜血管、神经的耐缺氧能力，抗氧化，清除自由基，免疫调节，双向调节神经细胞内钙离子浓度等作用。

　　青光眼视功能损害是不可逆的，因此对活体视功能损害的评价，明确其病变过程，早期诊断，早期药物治疗或其他干预就显的尤为重要。mfERG是从多道输入的ERG视野地形图衍生而来的一种视觉电生理检查法，可以在数分钟内同时记录视网膜不同部位的电反应，分别提取波形，反映视网膜不同层次细胞功能变化。mfERG可以敏感的反映视网膜节细胞的功能，FOK振幅与神经纤维轴突丢失数量呈负相关。本结果显示，补肾活血高、中剂量组有助于总波及1，2，3，4环P1波反应密度、总波P1波峰潜时、2环及3环N1波反应密度，3环、4环N1波峰潜时的恢复。提示补肾活血中药高、中剂量组可以部分改善慢性EIOP大鼠的mfERG。通过对mfERG和RGCs超微结构的观察发现，补肾活血具有有效的保护视功能免受高眼压损害的作用，其作用机制可能为：补肾活血可以改善局部微循环，增加眼血流量，改善轴浆流,增强视网膜血管、神经的耐缺氧能力，激活视细胞，复苏视纤维有关。

　　【参考文献】

　　1　葛坚.青光眼的研究进展与发展趋势.中华眼科杂志2000;36(3)：194

　　2　Maumenes AE. Cause of optic nerve damage in glaucoma. Ophthalmology1983 ;90 :7

　　3　Ball SL, Petry HM. Noninvasive assessment of retinal function in rats using multifocal electroretinography. Invest Opthalmol Vis Sic 2000;41(12):610617

　　4　Nusinowitz S, Heckenlively JR. Rod multifocal electroretinograms in mice. Invest Opthalmol Vis Sic 1999;40(12):28482858

　　5　Nickells RW. Retinal ganglion cell death in glaucoma:the how,the why,and the maybe. J Glaucoma 1996;5(5):345356