贝母素甲对体外培养甲状腺相关眼病患者眼眶成纤维细胞增殖的影响

　　作者：李蓓，郑燕林，刘文舟 作者单位：1(610051)中国四川省成都市，成都416医院眼科;(610074)中国四川省成都市，成都中医药大学附属医院眼科;(750004)中国宁夏回族自治区银川市，解放军第五医院眼科

　　【摘要】 目的:观察贝母素甲(PM)对体外培养甲状腺相关眼病患者眼眶成纤维细胞(orbital fibroblast, OF)增殖的影响。方法:采用体外培养的正常人和甲状腺相关眼病患者的OF，将PM和阳性对照药物地塞米松(Dex)分成不同浓度组，以MTT法检测其对细胞增殖的影响。结果:对体外培养甲状腺相关眼病患者OF的增殖，PM具有与Dex相似的抑制作用，二者均有明显的剂量依赖性。但PM对甲状腺相关眼病患者OF增殖的抑制作用明显优于正常人(P<0.05)，而Dex则无此选择性。结论:浙贝抑制了甲状腺相关眼病患者OF的增殖。

　　【关键词】 浙贝提取物;甲状腺相关眼病;眼眶成纤维细胞;增殖

　　Influence of the Fritillaria thunbergiis extract on the proliferation of the cultured orbital fibroblasts of TAOpatients　Department of Ophthalmology, 416 Hospital, Chengdu 610051, Sichuan Province, China;Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610074, Sichuan Province, China; Department of Ophthalmology, the Fifth Hospital of Chinese PLA, Yinchuan 750004, Ningxia Autonomous Hui RegionAbstractAIM:To observe the influence of the Fritillaria thunbergiis extract on the proliferation of the cultured orbital fibroblasts (OF) of the thyroidassociated ophthalmopathy (TAO)patients.METHODS:The cultured OF of the normal and the TAOpatients was introduced. The Fritillaria thunbergiis extract and the Dexamethasone(Dex) as the positive contrast medicine were devided into different groups to detect the influence of the Fritillaria thunbergiis extract on the proliferation of the cultured OF of the normal and the TAOpatients by the MTT method.RESULTS: The Fritillaria thunbergii's extract showed a similar result to Dex in inhibiting the proliferation of cultured OF of the TAOpatients, and both of them showed the dosedependence. But the inhibition of the Fritillaria thunbergiis extract to the proliferation of the TAOpatients OF was better than the normal obviously (P<0.05), and the Dex had no this selectivity.CONCLUSION:The Fritillaria thunbergii inhibit the proliferation of TAOpatients' OF.

　　KEYWORDS:Fritillaria thunbergii extract;thyroidassociated ophthalmopathy; orbital fibroblasts; proliferation

　　0　引言

　　甲状腺相关眼病(thyroidassociated ophthalmopathy，TAO)是一种临床上较顽固而且棘手的病症,迄今尚无特效药物能迅速有效地控制，并获一致性的长期缓解。在治疗该病的中药复方中，浙贝是出现频率很高的药物[15],但目前尚未见到有实验研究的相关报道，因此我们通过在体外培养的眼眶成纤维细胞(orbital fibroblast,OF)中加入浙贝活性成分贝母素甲(PM)，以地塞米松(dexamethasone,Dex)为对照药物，采用MTT比色法，观察二者在不同浓度时，对TAO患者及正常人眼眶成纤维细胞(OF)增殖的影响，探讨其作用机制。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　病例组球后脂肪结缔组织标本来源于核工业416医院眼科行深层眶脂肪切除术的严重TAO患者4例4眼，男1例，女3例;右眼2例，左眼2例;年龄39～56(平均44.5)岁;病程15～48(平均27.5)mo。患者均因严重的暴露性角膜炎、进行性视力减退及无法接受的眼外观而要求行手术治疗。正常对照组来源于2例角膜穿通伤后要求摘除眼球并行义眼植入的患者;年龄33和40岁，男女各1例，均排除其他免疫性和炎症性疾病。贝母素甲(PM,中国药品生物制品检定所);地塞米松(dexamethasone，DEX)：泗水希尔康制药有限公司; MTT和DMSO(美国Sigma公司);550免疫酶标仪(美国BioRad公司)。PM的配制[6]:称取1mg后,加入双蒸水20μL，加入1mol/L HCl溶解，调pH为7.0，并以DMEM液稀释至所需浓度，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用。

　　1.2　方法

　　利用手术台上取下的眼眶脂肪结缔组织标本，参照郑健墚等[7]的方法，采用组织块培养法培养传代，2～4代细胞用于实验。取生长良好的同代TAO及正常人OF，胰酶消化后在细胞计数仪下计数，按5×103/孔接种于96孔板中，并设无细胞空白对照组及无药正常对照组，培养48h后用PBS冲洗各孔3次，改用无血清的DMEM培养液继续培养24h,消除血清对细胞增殖的影响。然后在实验孔中加入含不同浓度PM(5,25,50,75,100mg/L)的培养液，总体积为200μL，每种浓度各设6个复孔，无细胞对照孔及无药对照孔只加培养液。继续培养48h后，弃去各孔上清液，加入20μL(5g/L) MTT继续培养4h，细胞表面形成紫色结晶样的甲臜。再次弃去上清液，加入DMSO 150μL，振荡摇均使甲臜完全溶解，以无细胞空白对照孔调零，酶标仪检测每孔的吸光度A值，以490nm单波检测。细胞生长抑制率(%)=(无药正常对照组A值实验组A值)/无药正常对照组A值×100%。以同样的方法检测Dex对OF增殖的影响，终浓度为Dex 0.01,0.1,1,10,100mg/L。

　　统计学分析：采用PEMS 3.0统计学软件进行统计分析。实验数据以±s表示，正常组与TAO组、PM和Dex对眼眶成纤维细胞干预结果的比较采用校正t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　几种浓度的PM对正常人及TAO患者的OF增殖都有一定的抑制作用，且伴有明显的剂量依赖性。PM对TAO患者OF的抑制作用明显优于正常人，结果具有统计学意义(P<0.05,图1A)。几种浓度的Dex对正常人及TAO患者的OF增殖都有明显的抑制作用，且伴有明显的剂量依赖性。Dex对正常人与TAO患者OF的作用结果无明显差异(P>0.05,图1B)。

　　3　讨论

　　TAO是最常见的眼眶疾病之一,其发病率占眼眶病首位,近年其发病率达1%左右。目前其病因和发病机制尚不完全清楚，病理学研究显示，该病以眼眶脂肪结缔组织和眼外肌体积增加及免疫活性细胞(主要是球后组织淋巴细胞和巨噬细胞)浸润为主要病理特征，亲水性的糖胺聚糖(GAG)和胶原蛋白沉积，后期结缔组织增生并发生纤维化。多数学者倾向于该病是一种与甲状腺疾病相关的器官特异性的自身免疫性疾病，眶结缔组织和眼外肌肌束膜的眼眶成纤维细胞(orbital fibroblast,OF)在TAO的发生和发展中起中心作用,既是靶细胞,同时又是效应细胞,表现出多种功能。Dex主要作用为抗炎及免疫抑制作用，用于TAO的治疗已有50多年的历史，取得了一定的疗效[8]。既往研究证实Dex可抑制成纤维细胞GAG的合成与释放,同时还可抑制多种细胞因子引起的眼眶成纤维细胞的增殖。但部分应用糖皮质激素疗效欠佳，长期用药会出现多种副作用，激素减量或停药后的复发问题是治疗中的又一难题。

　　中医[911]对突眼的认识逐步加深,认为突眼的发生大多与情志变化有关,气滞、痰凝、血瘀为基本病理变化,肝阴不足、气阴两虚为病之根本，病理特点是本虚标实,虚实夹杂，治疗当以活血消瘀、化痰散结为基本治疗原则。

　　贝母为百合科(Liliaceae)，贝母属(Fritillaria)多种植物的干燥鳞茎，为传统中药之一。浙贝载于《本草纲目拾遗》,《百草镜》云:"浙贝出象山,俗称象贝母"。其味苦,性寒，具有清热化痰、散结消肿等功效，系治疗瘰疬痰核之古方“消瘰丸”的主药。浙贝的活性成分较为明确，主要含贝母碱(贝母素甲),去氢贝母碱(贝母素乙)，其中贝母素甲(Peimine)是其主要活性成分之一，属异甾类生物碱中的瑟文类(Cevine groups)生物碱[12]。此外,尚含胆碱以及二种中性甾类化合物:前贝母碱(Propeimine)及植物甾醇。现代究其药理作用为：镇咳、祛痰、平喘作用、抗菌作用、镇静、镇痛等多种作用[13]。另外，陈泽乃等[14]根据4种贝母抑制由血小板活化因子(PAF)诱导血小板聚集的有效部位筛选结果，从平贝母的水溶性活性部位中分得胸苷和腺苷等成分，实验表明腺苷为抑制血小板聚集的主要成分，最近报道腺苷尚能活化白细胞上的 A2受体，有效地阻止 PAF诱导的白细胞内皮细胞黏附而参与抗炎过程，提示贝母可能有抗炎作用。之后，张明发等[15]首次发现浙贝母具有较强的抗渗出性炎症的作用。抗肿瘤作用研究显示从蒲圻贝母中提取的蒲贝酮碱具有强的抗小鼠艾氏腹水癌(EAS，实体型)、宫颈癌(U14，实体型)及肝癌(HePA，实体型)的活性。鄂北贝母的抗肿瘤实验结果表明，其总生物碱对小鼠移植肝实体瘤具有明显的抑制作用，口服10mg/kg共8d，肿瘤抑制率与相同剂量的 5FU相当,进一步研究表明，其抗肿瘤成分为鄂贝定碱、浙贝素甲和浙贝素乙。

　　结果提示，PM对体外培养的OF的增殖具有与Dex相似的抑制作用，二者均伴有明显的剂量依赖性，但在我们所选取的浓度范围内，其作用不如Dex强，且对TAO患者OF的抑制作用明显优于正常人，结果具有统计学意义(P<0.05)，而Dex则无此表现。本实验中，虽然证明了药物的有效性，由于时间关系，药物筛选的具体浓度均来自于文献报道中，因此，下一步实验可就具体用药浓度进行更为准确的筛选，以指导药物研发。浙贝是中医药治疗本病的常用药，但目前尚未见到相关实验报道，别的单味中药用于治疗本病的报道较多，但大多数为临床观察，极少有对其机制的实验研究，故我们采用体外细胞培养的模式，进行中药单味药物的初步筛选，为下一步研究治疗本病的中药复方打下基础，并试图以现代医学的实验方法去诠释古老的传统医学，以获得更多人的理解和认可。

　　【参考文献】

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　　15　张发明，沈雅琴，朱自平，等.浙贝母的抗炎和抗腹泻作用.湖南中医药导报 1998;4(10)：3031