槲皮素在兔小梁切除术后抗瘢痕作用的实验研究

作者：罗莉莎，刘苏作者单位：重庆医科大学附属第二医院 眼科，重庆 400010        【摘要】  目的 探讨槲皮素（quercetin，QU）在兔眼小梁切除术后抑制瘢痕形成的可能性及作用机制，为临床应用提供理论依据。方法 选择54只兔眼行标准小梁切除术，术后A组予眼膏基质，B组予QU眼膏，C组不予特殊处理。术后大体及裂隙灯检查，并记录滤过泡得分。于术后第1周、第2周、第4周处死动物，行组织学检查和Masson三色染色法观察滤过道新生胶原纤维的增殖情况。应用链酶亲和素免疫组织化学方法（SABC法）检测各组在结膜滤过泡中转化生长因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）和转化生长因子-β1受体（TGF-βR1）的含量。结果 各组均未见严重并发症，B组滤过泡得分高于其他两组。HE染色见A组滤过道被大量胶原堵塞，Masson染色显示胶原密度高，且TGF-β1和TGF-βR1的免疫组化染色呈强阳性表达。B组滤过道开放时间较A组长，且胶原纤维更稀疏；Masson染色，各时间点B组胶原纤维的密度较A组低（P＜0.05）； TGF-β1和TGF-βR1的表达呈弱阳性（P＜0.01）。C组滤过泡得分及滤过道情况与A组差异无显著性。结论 QU能抑制滤过术后结膜下过分瘢痕化，其作用机制之一为抑制TGF-β1和TGF-βR1的表达。 【关键词】  槲皮素；小梁切除手术；转化生长因子-β    青光眼滤过手术是治疗青光眼的重要手段，如何进一步提高小梁切除术的成功率而又减少辅助应用抗代谢药物如丝裂霉素C（mitomycinC，MMC）等所致的并发症仍是个急待解决的问题。槲皮素（quercetin，QU）属类黄酮物质，近几年来实验发现QU具有抗肝脏、肾脏及瘢痕疙瘩纤维化的作用[1~3]。我们前期体外实验也证明QU对兔Tenons囊成纤维细胞有抑制作用。本实验旨在探讨QU抑制结膜下瘢痕形成的可能性及作用机制，为临床应用提供理论依据。    1  材料和方法    1.1  QU眼膏的制备  称取QU（美国sigma公司）200 mg置于灭菌乳钵中研磨成极细粉末，加入少量灭菌液体石蜡，继续研磨成糊状，然后加入少量灭菌眼膏基质（眼膏基质的组成为黄凡士林8份，液体石蜡1份，羊毛脂1份）至总重量达20 g，研磨均匀即得。用无菌软管分装。    1.2  实验动物及分组  选用健康新西兰大白兔，雌雄兼用，体重1.8~2.5 kg，由重庆医科大学实验动物中心提供。54只兔眼分三组，每组18只兔，行标准小梁切除术。A组术后给眼膏基质；B组术后予QU眼膏；C组术后不给予特殊处理。    1.3  模型制备  所有手术实验动物采用速眠新(复合麻醉剂)1.0~1.5 g/kg肌注麻醉，选择兔鼻上或颞上象限做以穹隆为基底的结膜瓣，行标准小梁切除术。术毕结膜下注射庆大霉素2万U，地塞米松2.5 mg。A、B两组术后立即给予相应眼膏并包扎，并于第2日起每日用药两次（每日早9 点和晚9点），直至处死动物。术后3 d内林可霉素眼液点眼，每日三次。

    1.4  术后大体及裂隙灯检查  术后每日在裂隙灯显微镜下观察术眼结膜、滤过泡、角膜、前房及晶状体并记录。根据滤过泡高度及其环绕角巩膜缘的范围，用数值表示滤过泡大小，以便分析。滤过泡高度分为0~4分，0分示滤过泡消失，4分示滤过泡极高。滤过泡范围按环绕角巩膜缘的范围记分，即0~12分。滤过泡实际得分为滤过泡范围的分数加上滤过泡高度的分数。每个滤过泡可得0~16分。

    1.5  组织病理学和免疫组化学检查  分别于术后第1周、第2周、第4周，向耳缘静脉注入空气处死各组各3只兔子，迅速摘除眼球，取5 mm × 5 mm滤过道处组织，用10%多聚甲醛固定，按常规石蜡包埋，5 ?滋m厚连续切片。

1.5.1  苏木素-伊红染色法

    主要观察不同时间各组滤过道的开放情况，及炎症细胞的浸润、成纤维细胞的生长。

    1.5.2  Masson三色染色法检测胶原含量

    切片制作方法同上，切片脱蜡至水，苏木素染5~10 min后盐酸酒精分化，置丽春红品红酸性溶液中染色5~8 min，蒸馏水冲洗，再用1%磷钼酸染1~3 min，直接浸入苯胺蓝液中5 min，迅速用水洗净，透明、中性树胶封片。

    计算机图像分析仪（成都金盘多媒体图像处理系统）测量5个视野巩膜瓣下阳性积分光密度和管壁的面积，计算其平均值，即平均光密度（OPTEM），相对反映滤过平面的滤过道阻塞程度，将两组平均光密度值进行比较。

    1.5.3  链酶亲和素免疫组化法（SABC法）检测转化生长因子（transforming growth factor，TGF)TGF-β1和TGF-βR1

    切片常规脱蜡，下行水化。按SABC法步骤做免疫组化检查TGF-β1和TGF-βR1。一抗分别是1∶100的TGF-β1和TGF-βR1，用PBS代替一抗做阴性对照。实验所用抗体和SABC试剂盒均为武汉博士德公司产品。

    结果采用金盘多媒体图像处理系统。测定条件：物镜放大倍数为20×10，每张切片随机测定5个视野的阳性染色密度，取5个视野的均值为结果。

    1.6  统计学方法  所得数据以x±s表示，采用t检验分析。

    2  结果

    2.1  大体及裂隙灯观察  所有术眼均未出现严重感染征象。术后三组术眼均出现了不同程度的结膜充血、轻度角膜水肿、前房渗出等。A组3只眼出现角膜血管翳，其余组未出现。但各组均未出现严重的术后并发症，如结膜伤口裂开、浅房浅、晶状体混浊等。

    术后第1天三组均可见滤过泡，弥散隆起，泡内有液体积聚。滤过泡得分在术后3 d内差异无显著性（P>0.05）。术后第3天以后，滤过泡得分出现差异。统计学分析可见，第5天时，A、C组与B组之间差异开始出现显著性（P<0.05），之后差异更为明显（P<0.01），即A、C组滤过泡得分明显少于B组。至第17天，C组所有术眼滤过泡消失，得分为零；第20天，A组所有术眼滤过泡消失，得分为零。此时，B组部分眼仍可见滤过泡，按前述评分标准计算平均分见表1。同时，A、C组比较差异没有显著性（P>0.05）。

    2.2  HE染色  A组在术后第7天表现如图1，结膜上皮下有大量炎症细胞聚集，可见新生毛细血管和活化的成纤维细胞，滤过道及结膜下间隙被大量成纤维细胞和新生稀疏胶原组织堵塞；第30天时细胞数量明显减少，代之为较为致密的瘢痕结缔组织。B组在术后第7天表现如图2，成纤维细胞的增殖和新生胶原明显少于A组，滤过道大部分开放，结膜下组织疏松，呈功能性滤过泡的形态；第14天时滤过道内成纤维细胞数量有所增加，并可见呈纤细波纹状的新生胶原纤维，但滤过道仍开放；第30天较稀疏的胶原充填在滤过道内，但仍有间隙存在。C组所观察到的情况与A组相似，滤过道及结膜下间隙被大量成纤维细胞和新生稀疏胶原组织堵塞，具体情况见图3。

    2.3  结膜组织中新生胶原纤维的情况  Masson三色染色法染色后，胶原纤维呈蓝色，肌纤维、胞质呈红色，胞核呈褐红色。A组结膜下及滤过道的位置均可见大量胶原纤维增殖，与正常巩膜组织的均匀平行排列有明显区别，且第30天时的胶原明显较第7天和第14天时粗大、致密（P<0.01）；B组上述位置也可以见到少量胶原纤维增殖，滤过道部分阻塞，相同时间点A组和B组比较，其阳性染色密度差异有显著性（P<0.05）；C组相同时间点与B组比较，其阳性染色密度差异有显著性（P<0.05），与A组比较，差异无显著性（P >0.05）（见表2）。

2.4  结膜组织中TGF-β1和TGF-βR1免疫组化染色情况

    2.4.1  TGF-β1的免疫组化染色  A组结膜滤过泡免疫组化染色为深黄色，TGF-β1呈强阳性表达；B组滤过泡免疫组化染色稀疏、密度较A组明显低，TGF-β1呈弱阳性表达（见图4,图5）。阴性对照的TGF-β1免疫组化染色为阴性。相同时间点A组和B组比较，其阳性染色密度差异有显著性（P<0.01）（见表3）。

    2.4.2  TGF-βR1的免疫组化染色  TGF-βR1阳性表达结果为结膜组织的细胞膜和（或）细胞质呈现棕黄色颗粒。A组细胞膜染色呈深棕黄色，TGF-βR1呈强阳性表达；B组隐约可见染成棕黄色的细胞膜轮廓，且颜色较浅，TGF-βR1呈弱阳性表达（见图6，图7）。阴性对照的TGF-βR1免疫组化染色为阴性。相同时间点A组和B组比较，其阳性染色密度差异有显著性（P<0.01）（见表3）。

    3  讨论

    成纤维细胞生物合成增加从而引起胶原过度沉积是组织瘢痕化的主要原因之一。Lee等[4]最早发现QU能够抑制小鼠成纤维细胞的转化，国内外学者相继对QU在抗瘢痕化方面进行了研究。

    本实验中，术后给予QU的兔眼，滤过泡存在时间延长，成纤维细胞的增殖受到抑制，滤过道开放的时间较未给QU组明显延长。我们在术后通过大体和裂隙灯观察了滤过泡存在的情况。抗青光眼滤过手术成功的关键应当归功于滤过泡的存在[5]。除了对滤过泡进行描述外，我们还根据滤过泡的高度及其环绕角巩膜缘的范围记分，用数值表示滤过泡的大小，从而有利于对三组间的差别进行统计学分析。统计学结果显示，从术后第3天起，三组情况出现了差别。A组得分较B组越来越低，在第20天时，A组不能看到隆起的滤过泡，滤过泡得分为零。

    同时HE染色和Masson染色均证明了QU组滤过道内的胶原纤维的密度较对照组低。Phan等[6]应用黄酮类化合物对体外培养的人成纤维细胞进行研究，证实了QU对成纤维细胞胶原网架的收缩有非常强烈的抑制作用。也就是说，QU不仅能够通过抑制胶原合成来抑制纤维化的发生，还可以通过抑制胶原网架的收缩减低纤维化的程度，这对于术后房水引流是非常有利的。

    实验中我们探讨了QU对TGF-β1和TGF-βR1表达的影响。已有研究表明[7]，在参与创伤修复的大量细胞因子中，TGF-β是调控胶原合成的最关键因子，它已被公认为器官纤维化的治疗靶标。它能够刺激成纤维细胞葡萄糖和氨基酸的转运，提高Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达和蛋白合成，同时抑制胶原酶活性并加强细胞与细胞外基质的结合[8]。TGF-β来源于血小板、巨噬细胞和其他一些细胞中，而它的受体存在于所有的细胞上。Phan等[3]还在体外用不同浓度的QU作用于瘢痕疙瘩中分离的成纤维细胞，通过免疫印记法发现QU能够抑制TGF-β1和TGF-βR1在成纤维细胞中的表达。我们的在体实验也证明了QU可抑制滤过泡成纤维细胞 TGF-β1和TGF-βR1的表达，这提示QU抗纤维化的机制之一就是抑制TGF-β1和TGF-βR1基因表达，从而减少成纤维细胞的增殖和胶原的合成。

    综上所述，槲皮素在小梁滤过术后抗瘢痕化方面有积极作用，并且槲皮素具有广泛存在，易于获取，安全性高，副作用少的特点。随着对其作用方式和作用机制研究的不断深入，它有望成为新一代抗纤维化药物。

【参考文献】  [1] Qi LH， Kang LP， Zhang JP， et al. Antifibrotic effects of genistein and quercetin in vitro[J]. Yao Xue Xue Bao，2001，36(9)：648-651.

[2] 徐向进，张荔群，王庆彪，等. 槲皮素对糖尿病大鼠肾脏的保护作用[J]. 中华内分泌代谢杂志，2001，17(5)：316-319.

[3] Phan TT， Lim IJ， Chan SY， et al. Suppression of transforming growth factor beta/smad signaling in keloid-derived fibroblasts by quercetin implications for the treatment of excessive scars[J]. J Trauma，2004，57(5)：1032-1037.

[4] Lee SF，Lin JK. Inhibitory effects of phytopolyphenolson TPA-induced transformation， PKC activation， and c-jun expression in mouse fibroblast cells[J]. Nytr Cancer，1998，28(2)：177-183

[5] Phan TT， See P， Tran E， et al. Suppression of insulin-like growth factor signalling pathway and collagen expression in keloid-derived fibroblasts by quercetin： its therapeutic potential use in the treatment and/or prevention of keloids[J]. Br J Dermatol，2003，148(3)：544-552.

[6] Phan TT， Lim IJ， Sun L， et al. Quercetin inhibits fibronectin production by keloid-derived fibroblasts. Implication for the treatment of excessive scars[J]. J Dermatol Sci，2003，33(3)：192-194.

[7] Cordeiro MF，Reichel MB，et al. TGF-β1，β2，β3 in vivo：effect on normal and mitomycin C-modulated conjunctival scar-ring[J]. Invest Ophalmol Vis Sci，1999，40(9)：1975-7982.

[8] Rossert J， Terraz-Durasnel C， Brideau G. Growth factors，cytokines， and renal fibrosis during the course of diabetic nephropathy[J]. Diabetes Metab，2000，26(Suppl 4)：16-24.