银杏黄酮苷元对氧化型低密度脂蛋白诱导的人主动脉内皮细胞氧化损伤的影响

动脉粥样硬化(atherosclerosis , AS)是伴有血管内皮细胞氧化应激增强的慢性炎症过程，升高的氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipopro- tein,ox-LDL)在启动和加速AS病变中发挥重要的作用;内皮细胞NADPH氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH oxi- dase)激活产生的活性氧(reactive oxygen spe- cies , ROS)在AS病变中扮演了关键角色。银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract,GBE)是从银杏树叶中提取出来的一种复杂混合物，主要有效成分包括黄酮试和内醋，其对心血管和神经系统的保护作用主要通过抗氧自由基损伤的机制实现。而银杏黄酮昔元 ( Ginkgo flavone aglycone, GA)是对天然GBE中的黄酮贰进行化学修饰去除糖基后获得的新型物质 (几种化合物的混合体，主要包括榭皮素、山奈酚及异鼠李素)。目前国内外对GA药理学方面的研究甚少，本研究旨在探讨GA对。x-LDL所致人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells , HAECs ) 氧化应激损伤的影响。

材料与方法

1细胞、试剂与仪器HAECs 6100、培养基 (ECM),胰酶( T/E )、中和液(TNS)均来自美国Sci- ence Cells公司。ox-LDL源于北京协和生物技术公司。VitE标准品为美国Sig m a公司产品。DMEM培养基为美国GI日CO公司产品。BCA蛋白浓度测定试剂盒、Western及IP细胞裂解液、ROS检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 检测试剂盒、NO检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒、NADPH氧化酶检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术公司。H F90 /H F240二氧化碳培养箱产自上海 力申科学仪器有限公司。倒置显微镜系统产自日本 Nikon公司。激光扫描共聚焦荧光显微镜产自日本 Olympus公司。FC酶标仪产自美国Thermo公司; 精科752 N型紫外分光光度计产自上海圣科仪器设备有限公司。

2 GA溶液的配制GA以GBE为原料，采用酸水解一重结晶法去除糖基后制备而成，由贵州省生化工程中心何照范教授惠赠。称取黄色GA干粉(主要成分:榔皮素44. 76、山奈酚43. 54、异鼠李素 5. 44，总黄酮昔元占总成分含量的93. 74 % ) 17 mg,用170 uL的DMSO助溶，使其终浓度为 100 mg/mL，存放，2周内使用。使用前用无血清的 DMEM培养基稀释，配制成不同使用浓度，GA(0,30, 60,90 mg/L) DMSO终浓度<0. 2%。

3细胞培养与分组干预在37 0C ,5%CO:条件下，用含5%胎牛血清、1%内皮细胞生长添加物、青霉素(100 U/L)和链霉素(100 },g/m L)的内皮细胞培养液培养日AECs。实验前将贴壁生长良好的日AECs 6100用胰酶消化后，混匀成细胞悬液，调整细胞浓度为 5 x105/mL，并分成6组:(1)空白对照组，加人200uL 无血清DMEM培养液;(2)ox-LDL组，加人100 uL无血清DMEM培养液十100 uL ox-LDL至终浓度为 150 mg/L; (3 ) GA30 mg/L组，加人100uL GA至终浓度为30 mg/L + 100 },L ox-LDL至终浓度为 150 mg/L;(4)GA60 mg/L组，加人100uL GA至终浓度为60 mg/L + 100 uL ox-LDL至终浓度150 mg/L; (5) GA90 mg/L组，加入100 uL GA至终浓度为 90 mg/L + 100 uL ox-LDL至终浓度为150 mg/L; ( 6 ) VitE组，加人100uL VitE至终浓度为 200 mol/L+100uL ox一LDL至终浓度为150 mg/L.

4邃哩蓝(MTT)法检测细胞存活率将细胞悬 液按5 x1了仔L密度接种于96孔板内，分别用上述不同的分组方式干预细胞继续培养24 h，随后每孔加人 20匹MTT,37℃,5 % CO2条件下培养4 h，弃上清，再加人150uL二甲基亚矾(DMSO)震荡10 min,酶标仪490 nm波长测定OD值。细胞存活率(%) (实验组OD4s。一调零组OD4so ) /(对照组OD4s。一调零组OD4so)x 100%，每组设6个复孔，取平均值。

5 CM-H2DCFDA荧光探针测定细胞内ROS 含量将等量的细胞悬液按5 x 105/孔密度接种于6 孔板内，分别用上述不同的分组方式干预细胞继续培养24 h后，按照试剂盒说明书操作，在激发光488 nm 发射光525 nm下用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察细胞内氧化.二氢二氯荧光黄(DCFH)产生的 2,7一二氯荧光黄(DCF)荧光强度的变化。利用Bio- m ias2001图像分析系统(四川大学图像图形研究所) 测定荧光图片平均光密度值。

6 SOD,NO,NADPH氧化酶和MDA测定分别用黄嘿吟氧化酶法、Griess Reagent法、酶联免疫法和硫代巴比妥酸法测定SOD,NO,NAD户日氧化酶和MDA。待干预细胞培养24 h后，收集细胞，用 PBS洗涤?-遍。严格按照相应试剂盒说明操作，用紫外分光光度计测定上述指标，实验重复3次.

7统计学方法应用SPSS 19. 0统计学软件进行统计分析。计量资料以X 1S表示，多组间比较进行方差齐性检验和单因素方差分析，P < 0. 05为差异有统计学意义。

结果

1各组细胞存活率比较(表们与空白对照组比较，ox-LDL组细胞存活率明显下降(p<0.05)} VitE组、GA30 m g/L组及GA60 mg/L组细胞存活率均在80%以上，明显高于ox-LDL组(P <0.05)，其中以GA60 mg/L组与空白对照组最接近，修复作用最强(P < 0. 05)。

2各组细胞内ROS含量比较(图1，表，)ox- LDL组细胞内荧光强度明显增强，呈团块状强荧光影像，荧光强度较空白对照组增强了，19%，差异有统计学意义(P < 0. 05 ) o与ox-LDL组比较，GA30 mg/L 组、VitE组及GA60 m g/L组细胞内荧光强度减弱，下降程度分别为15.7 % ,24. 9%和42.0，差异均有统计学意义(P < 0. 05，以GA60 mg/L组ROS清除作用最强。

3各组细胞内SOD, NO,NADPH氧化酶及 MDA比较(表2)与空白对照组比较，ox-LDL组 SOD活力单位及NO含量降低，NADPH氧化酶及 MDA含量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与 ox-LDL组比较，GA30 mg/L组、GA60 mg/L组及 VitE组SOD活力单位和NO水平升高，NADPH氧化酶及MDA含量降低，差异均有统计学意义(p< 0. 05)，以GA60 mg/L组作用更明显(P < 0. 05)。

讨论

血管内皮细胞结构损伤和功能失调是AS发生的始动因素，ox-LDL所致的ROS蓄积通过增加钙离子水平激活细胞内信号通路和改变细胞内蛋白的氧化还原状态，使脂质氧化，钻附分子表达，基质金属蛋白酶激 活，内皮细胞凋亡，最终导致AS的发生与发展. ROS调节生物信号转导通路依赖于ROS生成上游依赖性配体的刺激和ROS的每条下游通路的相互作用，而NADPH氧化酶是一种多亚单位酶复合体，可将电子从NADPH传递给O:而生成超氧阴离子自由基 (O2-)，目前被认为是血管内皮细胞生成ROS的主要酶体[3,4]。而SOD是清除ROS的主要酶体之一，不仅清除(O2-)，也可灭活。x-LDL，从而稳定体内的抗氧化动态平衡，减少内皮细胞损伤或暴露于O2-诱导的细胞凋亡。Cominacini L等[5]最早研究发现，ox- LDL与血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1 (LOX-1结合后可迅速诱导内皮细胞ROS升高，特别是O2-和过氧化氢显著升高，升高的ROS除作为第二信使外，还直接作用于内皮细胞，使NO失活，胞膜脂质过氧化。BaiYP等的研究发现，ox-LDL可以使人脐静脉内皮细胞中的NADPH氧化酶2 (gp91 phox)表达上调，并且能诱发过氧化物释放，有短暂的剂量依赖关系。Park DW等[7]发现。x-LDL可以将人冠状动脉内皮细胞中的NADPH氧化酶4激活，从而促进ROS 的生成。此外，NADPH氧化酶产生的血管过氧化物的增多抑制内皮细胞NO合成酶的活性并加速NO的降解，使有活性的NO减少而导致内皮功能失调. 本研究显示150 mg/L ox一LDL与HAECs孵育24 h 不仅显著降低细胞活力，还增加ROS含量及MDA水平，抑制NO分泌，充分证实了。x-LDL对内皮细胞的氧化损伤，与上述研究结果一致，其作用机制可能是 ox-LDL诱导NADPH氧化酶的表达增加，产生大量的O2-，O2-的增多可降低SOD的活性并大量消耗 SOD，使抗氧化平衡失调，无法消除的O2-又进一步修饰低密度脂蛋白(LDL)形成。x-LDL，诱导NADPH 氧化酶的活化产生爆炸效应释放更多的ROS[8,9]. GBE是当今国际市场上特别推崇的治疗和预防心脑血管疾病的天然抗氧化物，而GBE中的黄酮是其抗氧化的主要成分。

目前多数研究采用的GBE为黄酮和内醋的复合物，且其中的黄酮95%以上是黄酮糖昔的形式存在。本实验所选用的GA是通过酸水解一重结晶法去除糖基获得的新型银杏黄酮提取物，糖基的去除增加了黄酮类化合物中的活性基团B环邻二酚基、3一经基与氧自由基反应的空间;黄酮昔元的浓度达到93. 74%，较天然GBE中的黄酮(24%) 明显提高;另外相比GBE中的黄酮多数被肠腔微生物降解代谢,GA可以直接通过小肠壁进人血液。上述优势使得GA被称为具有高生理活性的GBE，但它对内皮细胞氧化损伤的保护作用机制的研究较少。本研究结果显示30一60 m g/L GA预处理显著抑制 ox-LDL诱导的日AECs细胞活力下降和氧自由基、脂质过氧化物MDA含量增高，提高NO水平，更关键的是同时抑制NADPH氧化酶及提高SOD活性。但本研究发现，GA对。x-LDL所致内皮细胞损伤的保护作用，并非浓度越高越好，90 mg/L GA可协同ox-LDL 加重对内皮细胞的损伤，其原因可能与GA强脂溶性在细胞内集聚影响细胞代谢有关。为了进一步证明 GA的抗氧化性，本实验选择了公认的抗氧化剂— VitE作为阳性对照，证实200 },mol/L VitE对ox-LDL 诱导的HAECs氧化损伤具有的一定的保护作用，但不及60 mg/L GA作用明显，显示了GA作为一种高生理活性的天然抗氧化物的潜力。 GA是包含山奈酚、榭皮素及异鼠李素等黄酮昔元的复杂成分，具有独特的药理活性，可以通过不同的作用环节和机制保护内皮细胞的氧化损伤。Ou HC 等。

研究发现，GBE可以通过减少ROS，促进SOD, 内皮一氧化氮合成酶( eNOS)表达，达到防止。x-LDL 诱导血管内皮功能紊乱的作用。Huang F等研究证实，GBE可以减少MDA，对Fee+或Cu:十介导的体外LDL氧化修饰具有明显的抑制作用，其作用途经可能与氧化应激相关。Rodriguez M等给予心脏搭桥术后患者GBE治疗2个月后，可观察到患者动脉粥样斑块形成的数量减少，血中SOD活性显著增高， ox-LDL与脂蛋白(a)浓度明显下降。结合笔者既往的研究证实，GA可明显抑制高脂联合内膜球囊损伤所致兔颈总动脉AS病变，同时血管处NADP日氧化酶2 ( NOX2 ) , NADPH氧化酶4 ( N OX4)蛋白、基因表达均明显下调,提示GA对于血管壁细胞的抗氧化作用不仅在于直接清除氧自由基，还可直接抑带 NAD尸H氧化酶及NOX家族，从而降低ROS生成，塌终抑制AS病变。

参考文献

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