转化生长因子?茁受体在不同年龄大鼠晶状体上皮细胞中的表达
发表时间:2009-06-29 浏览次数:902次
作者:王柏川 叶剑作者单位:第三军医大学大坪医院野战外科研究所 眼科,重庆 【摘要】 目的 探讨转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)受体在不同年龄SD大鼠晶状体上皮细胞中的表达变化及意义。方法 按1、3、6个月鼠龄分为3组,采用晶状体前囊膜铺片方式,应用荧光免疫组化技术进行TGF-β受体TGF-βR1和TGF-βR2的荧光免疫组化染色,检测其蛋白水平的表达;采用剥取晶状体囊膜组织方法,应用RT-PCR技术检测TGF-βR1和TGF-βR2在转录水平的表达。结果 在蛋白水平,TGF-βR1和TGF-βR2于1个月鼠龄组表达最强,IOD分别为478001±44417和778338±62596; 3个月鼠龄组表达减弱,分别为360343±33196和360343±33196;6个月鼠龄组表达最弱,分别为225858±23483和274648±29801,组间差异有显著性(P<0.05)。在转录水平,TGF-βR1和TGF-βR2 mRNA表达量在1个月龄组分别为3.0±0.9和3.4±1.1;3个月龄组分别为2.1±0.6和2.6±0.8; 6个月龄组分别为1.3±0.3和1.6±0.5,随着年龄的增加而减弱(P<0.05)。结论 大鼠晶状体上皮细胞中TGF-βR1和TGF-βR2的表达随年龄的增长而减弱,提示对TGF-β的敏感性与年龄呈负相关。 【关键词】 转化生长因子β 转化生长因子受体 晶状体上皮细胞 转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一类多功能的调节细胞生长、分化的细胞因子,它对晶状体上皮细胞的影响主要表现为促进晶状体上皮细胞分化,抑制晶状体上皮细胞的增殖,并与晶状体上皮细胞的纤维化生长及凋亡密切相关,在白内障形成机制中有重要作用。TGF-β是通过与相应受体的结合而发挥其生物学作用的,我们拟通过RT-PCR与荧光免疫组化手段,了解不同年龄段大鼠晶状体上皮细胞中转化生长因子β受体(TGF-β receptors,TGF-βR)表达的变化,探讨TGF-βR的表达与年龄间的关系。 1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 健康SD大鼠来自第三军医大学野战外科研究所实验动物中心,鼠龄1~6个月,雌雄不限,动物质量符合国家《实验动物管理条例》。根据鼠龄分为3个实验组,即1个月鼠龄组(85~100 g)、3个月鼠龄组(280~310 g)和6个月鼠龄组(330~420 g)。 1.2 仪器与试剂 解剖显微镜(Leica MZ95),激光共聚焦显微镜(Leica TCS NT),PCR仪(Bio-Rad),水平电泳仪(Bio-Rad),凝胶成像仪(Bio-Rad);TGF-βR1、TGF-βR2兔抗人多克隆抗体(武汉博士德),标记FITC羊抗兔IgG及碘化丙啶(北京中杉),Tripure(罗氏公司),RT-PCR试剂盒(TaKaRa生物工程有限公司),PCR引物根据TGF-βR1 mRNA序列(L26110)和TGF-βR2 mRNA序列(NM031132)进行设计,内参引物根据GAPDH mRNA序列(NM002046)设计,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,其序列见表1。
1.3 转化生长因子受体的荧光免疫组织化学染色
SD大鼠经腹腔麻醉后,摘取双眼球,于角膜缘处剪开眼球壁,取出晶状体,在解剖显微镜下撕取前囊膜组织片,平铺于防脱载玻片上,细胞面朝外,以多聚甲醛固定1 h;0.01M PBS漂洗10 min×2次,正常羊血清封闭30 min,0.01M PBS漂洗10 min,加一抗(TGF-βR1或TGF-βR2,1:20),37℃孵育1 h,室温过夜,0.01M PBS漂洗10 min×3次,加荧光二抗(羊抗兔/FITC,1:50),37℃孵育1 h,0.01M PBS漂洗10 min×3次,以碘化丙啶(PI)行胞核复染10 min后,用甘油封片,于激光共聚焦显微镜下观察并在相同条件下摄片;每个实验组取4只大鼠,可获得8个前囊膜铺片,分别行TGF-βR1、TGF-βR2检测,以绿色荧光为阳性表达,每张玻片随机取3个视野摄片,利用Image-Pro Plus 6.0软件计算每个视野中绿色荧光的累积光密度值(IOD)。
1.4 转化生长因子受体的逆转录-聚合酶链反应
1.4.1 总RNA提取 取2只大鼠共4个晶状体,剥取囊膜组织并剪碎,加入1 ml TriPure,振荡、混匀后室温静置5 min,加入氯仿0.2 ml,混匀后室温静置15 min,离心(4℃,12000×g)15 min,吸取上层透明液体约0.25 ml,加入异丙醇1ml,混匀后室温静置10min,离心(4℃,12000×g)10 min,弃上清液,加入75%乙醇1 ml,混匀并离心(4℃,7500×g)5 min,弃上清液,加入无水乙醇1 ml,混匀并离心(4℃,7500×g)5 min,弃上清液,加入10 μl DEPC水溶解,即得到所需总RNA。测OD值(260 nm/280 nm)均在1.8~2.0间,提示RNA纯度理想,RNA浓度为120~140 μg/ml,提示RNA含量较低。每个实验组各取8只大鼠,每组可获得4个RNA样本,进行逆转录及PCR扩增。
1.4.2 逆转录(RT) 取总RNA 0.5 μg,分别加入MgCl2 2 μl,10×RT Buffer 1 μl,dNTP Mixture 1 μl,RNase Inhibitor 0.25 μl,AMV逆转录酶0.5 μl,Oligo-dT 0.5 μl,补足去离子水,配制成10 μl反应体系;经30℃反应10 min,42℃反应30 min,99℃反应5 min,5℃反应5 min后,得到RT产物。
1.4.3 PCR扩增 取1 μl RT产物作为模板,分别加入5×PCR Buffer 5 μl,Taq酶0.125 μl,上游引物1 μl,下游引物1 μl,去离子水16.875 μl,配制成25 μl反应体系;先经变性94℃ 5 min,再通过变性94℃ 30 s,退火(TGF-βR1 58.7℃,TGF-βR2 61.5℃,GAPDH 58℃)30 s,延伸72℃ 45 s,循环35次,最后再延伸72℃ 10 min,得到PCR产物;各取5 μl PCR产物,经1.5%琼脂糖凝胶电泳(80 V, 1 h),凝胶成像仪摄片并计算目的条带光密度值,以GAPDH光密度值作为标准对比。
1.5 统计学方法 所得数据利用SPSS 8.0软件,以x±s表示,采用单因素方差分析方法。
2 结果
2.1 大鼠晶状体上皮细胞中TGF-βR1和TGF-βR2的表达及分布 TGF-βR1在大鼠晶状体上皮细胞中主要表达于胞膜及胞浆,呈非均一性的颗粒样阳性着色,并且大多数细胞都表达TGF-βR1(见图1-A~C);TGF-βR1在1个月鼠龄组表达较强, 3个月鼠龄组表达减弱,6个月鼠龄组表达最弱,提示TGF-βR1在大鼠晶状体上皮细胞中的表达随年龄的增长而减弱(见表2)。
TGF-βR2在1个月鼠龄组主要于分布胞核、胞浆与胞膜(见图2-A),且表达较强;在3个月鼠龄组可见胞浆表达明显减少,胞膜表达已不明显(见图2-B),主要见于胞核及核周胞浆表达;在6个月鼠龄组,TGF-βR2的分布与2个月鼠龄组相似(见图2-C),但表达进一步减弱,各组差异有显著性(P<0.05),提示TGF-βR2在大鼠晶状体上皮细胞中的表达随年龄的增长而减弱(见表2)。
2.2 RT-PCR结果 PCR产物凝胶电泳结果显示,每组样本可扩增出3个目的条带,分别为457 bp的TGF-βR1、328 bp的TGF-βR2和392 bp的GAPDH(见图3);GAPDH在三组样本中表达稳定,无明显差异(P>0.05),TGF-βR1和TGF-βR2在1个月鼠龄组表达最强,在3个月鼠龄组表达减弱,在6个月鼠龄组表达进一步减弱;计算光密度比值(TGF-βR/GAPDH)作为TGF-βR1和TGF-βR2 mRNA的表达量(见表3),经检验,各组内差异有显著性(P<0.05),提示TGF-βR1和TGF-βR2在大鼠晶状体上皮细胞中mRNA的表达随年龄的增长而减弱。
3 讨论
TGF-β对晶状体上皮细胞的主要作用是抑制细胞增殖,促进细胞分化,这种分化作用包括两个方面,一方面是促进晶状体立方形上皮细胞分化为晶状体纤维细胞,是正常的生理发育过程;另一方面则是促进上皮细胞异常分化,导致细胞变长、梭形细胞样改变以及成纤维细胞化,并且可致细胞内细胞器减少,RNA聚集,细胞质凝集,二级溶酶体明显增多等,出现细胞凋亡[1-2],是一个病理过程,与白内障形成关系密切。已有实验表明,TGF-β可在体内及体外引起白内障样改变[3-5]。
TGF-β通过与相应受体结合,引发信息传递,从而发挥其生物学作用。TGF-β受体主要有TGF-βR1、TGF-βR2和TGF-βR3三型,其中TGF-βR3并不参与信号传递过程,也不介导TGF-β的生物学效应,TGF-βR1、TGF-βR2是主要的功能性的受体,介导几乎所有的TGF-β功能,TGF-βR1要有TGF-βR2的同时参与才能与TGF-β结合,而TGF-βR2虽然不需要TGF-βR1的存在就可以与TGF-β结合,但必须有TGF-βR1同时参与才能进行信息传递,因此,两种受体形成聚合体对于TGF-β和细胞之间的信息传递十分重要[6]。研究TGF-β对晶状体上皮增殖与分化的影响时,应考虑到其相应受体表达的情况。有关晶状体上皮细胞TGF-β受体表达与年龄间的关系少见报道。我们实验中采用的1~6个月龄大鼠,大致反映了大鼠由幼年到成年的变化。结果提示,大鼠由幼年至成年过程中,晶状体上皮细胞中TGF-βR1和TGF-βR2在转录及蛋白水平的表达逐渐降低,提示对TGF-β的敏感性与年龄呈负相关,说明晶状体发育成熟后,其上皮细胞分化活动逐渐减弱,进入一个发育稳定期。
白内障手术后,房水中bFGF和TGF-β含量增加[7],bFGF促进残留的上皮细胞增殖并移行到后囊膜,TGF-β则促进上皮细胞转分化为梭形细胞,多层排列,聚集成斑块样,使囊膜皱缩,形成后发障[8]。我们的结果发现,幼年晶状体上皮细胞比成年晶状体上皮细胞同时表达更多的TGF-β1和TGF-β2受体,提示两者形成的聚合体对TGF-β更敏感,也说明儿童白内障术后比成人更容易发生后发障。
长期应用糖皮质激素可引起激素性白内障,可能也与TGF-β或/和TGF-β受体异常表达有关,由于糖皮质激素可能影响TGF-β受体表达,增殖、移行至赤道部的晶状体上皮细胞不能正常分化,则继续移行至后囊下堆集,形成后囊下混浊[9-10]。流行病学资料表明,儿童较成人对激素更敏感,更易发生激素性白内障[9-11]。从受体表达角度分析,可能是发育过程中,幼年晶状体上皮细胞中较成年晶状体有更多的TGF-β受体表达,因糖皮质激素的抑制作用,幼年晶状体上皮细胞中TGF-β受体较成人下降剧烈,细胞的正常分化抑制更明显,而成人晶状体上皮细胞已处于发育稳定期,虽然TGF-β受体表达也受到抑制,但所受到的影响不如处于旺盛发育过程中的幼年晶状体上皮细胞。
由以上分析可以看出,由于儿童晶状体上皮细胞表达更多的TGF-β受体,对TGF-β敏感,使得更容易发生后发障及激素性白内障,因此我们推测,儿童有可能较成人更容易发生与TGF-β及其受体密切相关的晶状体疾病。
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