三氧化二砷体外抑制A375黑色素瘤细胞的生长及谷胱甘肽过氧化物酶的活力

　　作者：应方微,唐松,刘桂琴    作者单位：518040）中国广东省深圳市眼科医院

　　【摘要】  目的：了解三氧化二砷(As2O3)对体外培养的A375黑色素瘤细胞的生长及谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响。方法：采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法检测1.5，3.0，6.0，12.0，24.0μmol/L As2O3与A375黑色素瘤细胞作用24，48，72h后对瘤细胞的抑制作用；测定共培养24h的A375黑色素瘤细胞所含的谷胱甘肽过氧化物酶活性。结果：各浓度As2O3对A375瘤细胞的生长均有明显的抑制作用， As2O3的浓度越高，增殖抑制作用越强；各浓度As2O3与A375黑色素瘤细胞作用24h后，瘤细胞的谷胱甘肽过氧化物酶活力均有明显的降低，分别为2.23±0.81，2.87±0.70，4.08±0.81，2.63±0.84，1.40±0.41mU/mL，在As2O3浓度为6.0μmol/L时，酶活性最高，低于此浓度或高于此浓度时，酶活力呈递减的趋势。经过统计学独立样本的t检验分析，差别有统计学意义。结论：As2O3对A375瘤细胞的生长有浓度依赖性抑制作用，As2O3显著降低A375瘤细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力。

　　【关键词】  三氧化二砷；A375黑色素瘤细胞；四甲基偶氮唑蓝；谷胱甘肽过氧化物酶

　　Inhibition effect of arsenic trioxide on the A375 melanoma cell growth and glutathione peroxidase activity in vitroFangWei Ying, Song Tang, GuiQin LiuShenzhen Eye Hospital, Shenzhen 518040, Guangdong Province, ChinaAbstractAIM: To understand the effect of arsenic trioxide (As2O3) on cultured A375 melanoma cell growth and glutathione peroxidase activity.METHODS: Using methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) reduction to assay the inhibition effect of 1.5, 3.0, 6.0, 12.0, 24.0μmol/L As2O3 on A375 melanoma cells for 24, 48, 72 hours, respectively. To determine the glutathione peroxidase activity of the A375 melanoma cells cocultivated with As2O3 for 24 hours. RESULTS: The growth o A375 tumor cells were inhibited by dosedepending As2O3 significantly. The higher As2O3 concentration was, the lower A375 cells proliferation was. 24 hours later, the glutathione peroxidase activity of the A375 cells was 2.23±0.81，2.87±0.70，4.08±0.81，2.63±0.84，1.40±0.41mU/mL respectively, and the 6.0μmol/L As2O3 had the highest activity. Below or above this concentration, the enzyme activity showed decreasing trend. After statistically independent samples ttests analysis, the difference was statistically significant.CONCLUSION: As2O3 can inhibit the growth of A375 tumor cells in a dosedependent manner and can reduce the A375 tumor cell glutathione peroxidase activity significantly.　　KEYWORDS: arsenic trioxide; A375 melanoma cells; methyl thiazolyl tetrazolium ; glutathione peroxidase引言

    眼睑皮肤恶性黑色素瘤是眼科比较常见的恶性肿瘤，三氧化二砷(As2O3)对实体肿瘤有一定的治疗作用，在体外诱导肿瘤细胞凋亡，抑制小鼠黑素瘤生长，但其作用机制不十分明确[1]，我们用不同浓度As2O3 对体外培养的A375黑色素瘤细胞生长，肿瘤细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响，探讨As2O3 杀伤A375黑色素瘤细胞的机制，现报告如下。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　As2O3（sigma），A375黑色素瘤细胞株（中国科学院上海细胞生物研究所），RPMI1640培养基（GIBCO）,胎牛血清（杭州四季青），酶标仪（THAM）,谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒（碧云天）。

　　1.2方法

　　以RPMI1640完全培养液培养A375瘤细胞株，置于37℃，50mL/L CO2培养，定期换液，传代，充分扩增细胞。设立As2O3终浓度分别为0,1.5,3.0,6.0,12.0,24.0μmol/L，在96孔细胞培养板上，每小组7孔，各加入2×105/mL的瘤细胞悬液200μL，将培养板置于37℃，50mL/L CO2培养箱分别培养24，48，72h。

　　1.2.1瘤细胞杀伤的测定

　　与 As2O3共培养24,48,72h的A375瘤细胞，每孔加入5g/L MTT液20μL，继续培养4h后吸除培养液，各加入二甲基亚砜200μL，充分混匀。在酶标仪上测定各组在波长492nm的吸光度A值，根据公式：细胞相对生长抑制率=1(实验组A值/对照组A值)×100％，计算各组A375瘤细胞的生长抑制率。表1As2O3对A375瘤细胞的生长的抑制的A340值和生长抑制率（略）

　　1.2.2谷胱苷肽过氧化物酶活性的测定

　　与As2O3共培养24h的A375瘤细胞，用细胞刮取下，加入PBS混悬后计数细胞，1000g离心5min，去上清，重复一次后，加入细胞裂解液成1×1014/L充分混匀，冰浴匀浆后4℃，12000g离心10min，取上清用于酶活性测定。设定空白对照（无样品）和样品本底对照（无过氧化物试剂溶液），取上述的样品上清4μL,GPx检测液10μL分别加入到182μL的谷胱苷肽过氧化物酶检测缓冲液中混匀，加入15mmol/L过氧化物试剂溶液4μL后及开始用酶标仪在25℃检测波长340nm的吸光度A340值，每隔30s检测1次，连续检测6个数据。根据公式：谷胱甘肽过氧化物酶活力（mU/mL）=[A340(样品)/minA340(空白)/min]/0.00622。    　　统计学分析：利用SPSS 13.0统计软件的独立样本t检验分析As2O3对A375瘤细胞的谷胱苷肽过氧化物酶活性的影响,以P＜0.05为有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 As2O3对A375瘤细胞生长的抑制作用

　　A375黑色素瘤细胞贴壁生长，核圆形或长椭圆形，不同浓度的As2O3与A375瘤细胞共培养24，48，72h后，与对照组相比，各浓度的As2O3对A375瘤细胞的增殖均有明显的抑制作用， As2O3的浓度越高，对培养的A375瘤细胞的增殖抑制作用越强，其中1.5μmol/L As2O3作用72h对A375瘤细胞的生长无抑制（表1）。

　　2.2谷胱甘肽过氧化物酶活性

　　各浓度As2O3与A375黑色素瘤细胞作用24h后，A375黑色素瘤细胞的谷胱甘肽过氧化物酶活力与对照组相比，均有明显的降低，在As2O3浓度为6.0μmol/L时， A375瘤细胞的酶活性相对最高，低于此浓度或高于此浓度时，酶活力呈递减的趋势（图1）。

　　3讨论    　　细胞内活性氧自由基(ROS)是细胞线粒体内氧化还原代谢的产物，参与细胞内的信号转导，与细胞生长凋亡有密切关系。大量研究表明，ROS可介导细胞信号转导，激活转录因子，促使基因表达，调控细胞生长、增殖和凋亡，发挥重要生物学效应。当细胞内ROS的生成和清除失衡及定位出现异常时，则会损伤组织细胞，甚至导致细胞的死亡。谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。它能使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2O2的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。As2O3是一种具有抗肿瘤作用的药物，目前已用于临床治疗急性早幼粒细胞白血病。As2O3诱导实体肿瘤细胞凋亡与细胞内ROS的水平改变有关[2，3]。As2O3 作为细胞毒性药物，它通过蛋白质的巯基结合，干扰细胞代谢，诱导肿瘤凋亡[4]。As2O3可直接与巯基形成复合物As(GS)，从而阻断由GPx作用下的H2O2还原为H2O的过程，降低其清除ROS的能力，间接地使ROS水平升高。结果提示，不同浓度的As2O3 均明显降低了体外培养A375黑色素瘤细胞谷胱甘肽过氧化物酶的活力，从而影响肿瘤细胞内ROS的清除，使得细胞内ROS含量上升，引起细胞损害及死亡。但是根据不同的As2O3浓度，谷胱甘肽过氧化物酶酶活力的水平又有所波动，在6.0μmol/L As2O3浓度下形成了谷胱甘肽过氧化物酶酶活力的小高峰，高于及低于此浓度，酶活力均呈现递减的趋势，这与实验中MTT法检测的肿瘤细胞体外杀伤A375黑色素瘤的结果并不完全吻合。体外杀伤实验显示，As2O3 体外杀伤A375黑色素瘤细胞呈现浓度依赖性，24h的作用下，As2O3 浓度越高，肿瘤细胞生长的抑制率越高，24μmol/L As2O3 时肿瘤细胞生长抑制率达到74.4%，随着浓度递减，生长抑制率逐渐递减，1.5μmol/L As2O3时生长抑制率至17.6%，由此可见As2O3 体外抑制A375黑色素瘤生长的作用机制很复杂，对谷胱甘肽过氧化物酶酶活力的抑制只是其中一个方面。

【参考文献】　　1夏俊，陈俊霞，于丽华,等．三氧化二砷抑制小鼠B16黑色素瘤生长作用及其机制.中国药理学通报 2004；20(9)：10541058

　　2 Jing Y，Dai J, Chimers Rechmn RM, et al. Arsenic trioxide selectivelv induces acute promyelocytic leukemia cell apoptosis via a hydrogeperoxide dependent pathway. Blood 1999；94(6)：21022111

　　3曹娟，郑杰．As203诱导肿瘤细胞凋亡依赖H202途径.中国病理生理杂志 2006;22(6)：11851190

　　4 Nicoletti I，Migliorati G，Pagliacci MC, et al. A rapid and simple method for measuring thyolocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Methods 1991;139(2)：271279