核转录因子-κB及抑制蛋白IκBα琢在黄斑前膜中的表达及临床意义

作者：李静    作者单位：山西省眼科医院 玻璃体视网膜科，山西 太原 030002 【摘要】  目的 研究核转录因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）P65亚基及抑制蛋白IκBα琢在黄斑前膜中的表达及临床意义。方法 用免疫荧光组织染色化学方法结合RT-PCR方法分别从蛋白水平及mRNA水平来研究20例原发性黄斑前膜、49例继发性黄斑前膜患者中NF-κB P65亚基及抑制蛋白IκBα琢的表达情况，用电镜观察其病理特征。15例正常黄斑区视网膜组织作为阴性对照。结果 正常黄斑区视网膜组织中的NF-κB P65和IκBα琢的免疫荧光组织化学染色方法及RT-PCR方法检测结果均为弱表达。NF-κB P65和IκBα琢在黄斑前膜组织中的表达明显高于正常黄斑区视网膜组织，差异有显著性（P<0.01）；继发性黄斑前膜组织中的NF-κB P65和IκBα琢的表达高于原发性黄斑前膜，差异有显著性（P<0.05）。结论 NF-κB P65和IκBα琢高表达与黄斑前膜的发生关系密切，参与了黄斑前膜的发生发展和NF-κB的激活，可能调控其他的一些蛋白质，共同作用导致黄斑前膜的发生，因此NF-κB可能是治疗黄斑前膜的新靶点。

【关键词】  原发性黄斑前膜 继发性黄斑前膜 核转录因子-κB P65蛋白 抑制蛋白IκBα琢

     核转录因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）是近年来发现的存在于细胞浆中的一种快反应转录因子，研究证明它调节的蛋白质包括细胞因子（IL-1、IL-2、IL-5、IL-8、VEGF等）、趋化因子（Eotaxin、AP-1、RANTENS等）、生长因子（TGF、C-CSF、GM-CSF等）、黏附分子（ICAM-1、CCAM-1）、免疫受体（TCR）、氧化应激相关酶以及急性期蛋白等，在多种生理和病理情况下有重要的作用[1-5]。在增生性玻璃体视网膜病变以及糖尿病性视网膜病变的增生膜及玻璃体液中都已经检测出NF-κB的高表达，证明NF-κB的活化与其发病有关[6]。黄斑前膜指黄斑及其附近视网膜内表面组织病理增生形成的纤维细胞膜，发病机制不是十分清楚。黄斑前膜分为原发性黄斑前膜和继发性黄斑前膜，该膜的收缩可引起黄斑区视网膜的解剖结构紊乱和视功能损害，目前尚无有效的药物治疗，手术剥除前膜有较好的效果[7]。寻找新的药物治疗是现在眼科研究的热点方向，而药物的选择最终取决于对病因学的深入研究。NF-κB与炎症反应、免疫应答以及细胞的增生、转化和凋亡等重要的生理病理过程密切相关，它的活化是否与黄斑前膜的发生直接相关，研究并证明核转录因子与黄斑前膜的关系，将为预防黄斑前膜的发生提供有价值的理论基础，指导临床。

    1  材料和方法

    1.1  临床资料  收集2004年5月～2006年5月在我院确诊为黄斑前膜的患者69例，其中原发性黄斑前膜20例，男4例，女16例，年龄53~72岁，中位年龄63.5岁，病程1~36个月（平均13.5个月）。继发性黄斑前膜49例，男28例，女21例，年龄15~67岁，中位年龄41岁，病程0.5～24个月（平均12.2个月）。正常黄斑区视网膜组织15例，取自我院角膜移植后的尸眼，材料均来自健康的青年人。

    1.2  主要试剂  鼠抗人P65单抗，兔抗人I?资Ba多抗购自Santa Crusz公司，异硫氰酸荧光素（FITC）标记山羊抗鼠，FITC标记山羊抗兔，由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。RT-PCR试剂由德国Qiagen公司提供，PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。

    1.3  实验方法  所有患者行常规玻璃体切割术切除混浊的玻璃体，用剥膜钩剥离黄斑前膜，并用镊子夹出膜组织。手术取出后69例中的41例经10％福尔马林固定，其中原发性黄斑前膜13例，继发性黄斑前膜28例，进行石蜡包埋，4 um切片。另外的28例即刻冻存于-70℃冰箱中，以备RT-PCR实验之用，其中原发性黄斑前膜9例，继发性黄斑前膜19例。无菌操作取出尸眼黄斑区视网膜组织15例，分别进行石蜡包埋和冻存-70℃冰箱备用。

    1.3.1  28例黄斑前膜组织以及15例角膜移植术后正常黄斑部视网膜组织，在0.1 ml研磨器冰上研磨后，根据厂家推荐的实验步骤进行操作，进行组织总RNA的提取。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测NF-κB的P65亚基及I?资Ba的表达。

    1.3.1.1  引物设计：

    P65：5′GGCCATGGACGAACTGTTCCC3′

    5′GGAGGGTCCTTGGTGACCAG3′（256 bp）

    IκBα琢：5′TGAGGACCAGCAGTGTCTTG3′

    5′CATCGTTGATCACAAGTCGG3′（345 bp）

    GAPDH：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′

    5′ TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′（450 bp）

    1.3.1.2  逆转录反应  用两步法完成，先提取DNA.将模板RNA置于冰上，慢慢解冻。10*BufferRT，dNTPMix，RNase-free water置于室温，解冻后立刻置于冰上。混合反应体系：用0.2 ml的反应管，10*Buffer RT 2 ul，dNTPMix 2 ul，Oligo-dtPrimer 2 ul，Ominiscriptreversetranscriptase 1.0 ul，Template RNA 2 ul，RNase-free water 11 ul，将反应体系用枪尖混匀，反应体系总共20 ul，于37℃水浴60 min。

    1.3.1.3  PCR反应体系及条件  dNTP Mix 1 ul，Taq酶0.5 ul，10*Buffer 2.5 ul，上游引物1 ul，下游引物1 ul，DNA 1ul，去离子水18 ul，反应体系总共25 ul，反应条件经预实验优化。反应条件：预变性95℃ 5 min，变性94℃ 1 min，退火54℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，从变性到延伸共34个循环，最后延伸72℃ 10 min。

    1.3.1.4  PCR产物于2%的琼脂糖凝胶电泳，产物结果用SynGene凝胶成像系统进行电泳条带分析，所检测指标的mRNA表达水平用相对表达量，即检测指标与GAPDH比值计算，实验重复3次。

    1.3.2  免疫荧光组织化学方法及共聚焦激光扫描检查：一抗：1：100，二抗：1：100，Dappi染核。以PBS代替一抗做阴性对照。实验说明均按试剂盒使用说明进行。采用LeicaTCS-NT型激光共聚焦显微镜软件操作，镜下免疫荧光组化染色阳性产物在细胞核和细胞浆中呈绿色荧光，在高倍镜下，随机选择每张切片的5个视野，每个视野记数200个细胞，计算阳性细胞占镜下细胞的百分比。按显色后阳性细胞的多少分为阴性及阳性：阴性（-）：整个切片未见阳性染色或阳性细胞率<5%，阳性（+）：阳性细胞率>5%。

    1.3.3  电镜观察黄斑前膜的病理特征。

    1.4  统计学方法  用SPSS10.0版软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较用方差分析。

    2  结果

    2.1  RT-PCR结果  黄斑前膜和正常黄斑区视网膜组织的NF-κB P65及抑制蛋白IκBαmRNA的表达：在正常黄斑区视网膜组织中，NF-κB P65 mRNA只有很微弱的表达，而在黄斑前膜组中NF-κB P65 mRNA的表达明显高于正常组（F=19.28，P<0.01），两组比较差异有显著性。继发性黄斑前膜组中的NF-κB P65 mRNA的表达明显高于原发性黄斑前膜组（F=13.97，P<0.05），两组比较差异有显著性。在正常黄斑区视网膜组织中NF-κB的抑制蛋白IκBαmRNA几乎没有表达，而在黄斑前膜组中IκBαmRNA的表达明显高于正常组（F=11.09，P<0.05），两组比较差异有显著性。继发性黄斑前膜组中的IκBαmRNA的表达明显高于原发性黄斑前膜组（F=9.21，P<0.05），两组比较差异有显著性（见图1，表1）。

    2.2  免疫荧光组织化学方法结果  各组平均NF-κB P65和IκBα琢染色阳性细胞率如表2：方差分析法检测结果显示，原发性黄斑前膜组、继发性黄斑前膜组与正常黄斑区视网膜组比较差异有显著性（P<0.01）；继发性黄斑前膜组和原发性黄斑前膜组比较差异有显著性（P<0.05）；原发性黄斑前膜组、继发性黄斑前膜组与正常黄斑区视网膜组比较差异有显著性（P<0.01）；继发性黄斑前膜组和原发性黄斑前膜组比较差异有显著性（P<0.05）。

    在免疫荧光组化结果中表明：P65和IκBα琢在黄斑前膜组织细胞的胞浆和胞核中均表达（见图2），而P65主要在胞核中表达，IκBα琢主要在胞浆中表达，其表达水平较正常视网膜组织也增高（P<0.05）。而在继发性黄斑前膜中的表达水平也要高于原发性黄斑前膜，两组比较差异有显著性（P<0.05）。上述结果提示NF-κB和IκBα琢的高表达与黄斑前膜的发生相关。

    3  讨论

    正常情况下， NF-κB/Rel二聚体与抑制型蛋白I?资B的亚基结合形成三聚体，以无活性的形式存在于胞质中[8]。在许多因素诱导下（如内毒素、细胞因子、活性氧和病毒感染等），NF-κB被激活，使胞浆中NF-κB/I?资B三聚体复合物中的I?资B磷酸化失活，而NF-κB活化进入细胞核，本实验结果也证明核移位现象。Jijon等[3-4，9]研究证明，NF-κB激活后启动或调节早期反应基因的转录，如激活后可促进多种炎症介质如细胞因子（TNF-?琢、IL-1、IL-8等）、黏附因子（ICAM-1、VCAM-1、P-selectin等）、趋化因子MCP-1等基因的转录，在炎症及增生方面起到重要的作用。

    国内外对NF-κB在眼科方面的研究很多，已经证实与多种眼科疾病相关。如研究表明NF-κB参与角膜新生血管的生成，在角膜基质炎的早期也在活化表达。在年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜上皮细胞中，也检测到NF-κB的异常活化。最近的研究提示NF-κB参与了小梁网氧化损伤引起的青光眼的发病过程。在未成熟儿视网膜病变、视网膜血管阻塞性疾病、老年性黄斑变性及糖尿病视网膜病变等疾病的发展过程中，也不同程度地检测到了高度活化的NF-κB[10-14]。我们的研究结果从蛋白质水平及mRNA水平证明了，黄斑前膜中的NF-κB P65和IκBα琢的表达量要明显高于正常黄斑区视网膜组织，而继发性黄斑前膜中的表达量要明显高于原发性黄斑前膜中的表达量，证明了NF-κB异常活化与黄斑前膜的发生直接相关。

    黄斑前膜病程早期主要为视网膜色素上皮细胞和成纤维细胞，少见胶质细胞。随着病程的进展，视网膜色素上皮细胞减少，主要为成纤维细胞，也见多量巨噬细胞。研究结果表明，黄斑前膜是随着病程的进展呈现动态的变化，细胞成分发生不断的变化。有研究证明[15]，视网膜色素上皮细胞可以分化为巨噬细胞和成纤维样细胞，并表达多种相应的生物功能，细胞迁移到视网膜表面和视网膜下表现出活跃的增生现象，参与了膜纤维化的形成过程。在本研究中，发现继发性黄斑前膜中含有大量的胶质细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、纤维细胞以及条索样结构，有的含有色素细胞（见电镜图3）。原发性黄斑前膜，主要由来自视网膜自身细胞及其各种衍生物或代谢产物所构成，因此主要由Müeller细胞和色素细胞构成。所以我们认为黄斑前膜含有多种细胞成分，根据形成原因和病程在发生变化，呈炎症及增殖改变。

    NF-κB功能很广泛，它的活化在炎症增生反应时复杂的细胞因子网络中可能是中心环节，遏制它的活化，可减少其对多种炎症介质的调控[16-20]。抗氧化剂如N-乙酰半胱氨酸（NAC）、 VitE衍生物、吡咯烷二硫氨基甲酸酯（PDTC）、硒蛋白、抗坏血酸、二甲基硫氧化物（DMSO）和S-丙烯基半胱氨酸（SAC）均可抑制NF-κB的活化。皮质激素强大的抗炎作用有部分是通过抑制NF-κB活化而实现的，我们在黄斑前膜的发病早期也应用皮质激素，因为糖皮质激素受体能直接作用于NF-κB的RelA从而抑制其与DNA结合，另一方面也能增加I?资Bα mRNA的表达并促进功能性I?资Bα蛋白质的合成，从而抑制NF-κB的活化。因此，以抑制NF-κB激活和减少炎症介质生成为目标的治疗策略对黄斑前膜的治疗和预防将会是有效的。我们的研究表明，NF-κB与黄斑前膜的发生密切相关，深入研究NF-κB、IκB和有关细胞因子的调节机制，将有助于我们从信号传导网络的方面更好地了解黄斑前膜发病机制，并开拓出以NF-κB、IκB或下游的细胞因子为药物靶点的治疗黄斑前膜途径，为黄斑前膜的治疗提供新的前景。

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