杞贞胶囊对大鼠视网膜节细胞的保护作用

作者：张海娟，马科，王津津    作者单位：首都医科大学附属同仁医院眼科中心 北京市眼科研究所，北京 100730 【摘要】  目的 通过大鼠视神经夹伤模型，探讨杞贞胶囊对视网膜神经节细胞的保护作用。方法 50只大鼠随机分为5组，每组10只，右眼制作视神经夹伤模型。阴性对照组、阳性对照组及低、中、高剂量组分别用生理盐水、4.69%益脉康及低（16.4 g生药/100 ml）、中（32.8 g生药/100 ml）、高（65.6 g生药/100 ml）剂量的杞贞胶囊溶液灌胃给药，每日1次，持续4周。动物安死术前5 d逆行标记节细胞，用彩色颗粒分析软件计数节细胞。结果 阴性对照组、阳性对照组和低、中、高剂量组节细胞平均存活率分别为(40.88±12.50)%、(59.34±9.19)%、(52.66±12.52)%、(59.39±7.45)%和(63.00±8.95)%。阴性对照组与低剂量组之间差异具有显著性(P=0.014)，阴性对照组与阳性对照组、中、高剂量组之间差异有非常显著性（P<0.01）。 结论 杞贞胶囊能有效地保护视网膜神经节细胞，随着给药剂量的增加，作用逐渐增强。益脉康也具有视网膜神经节细胞保护作用。

【关键词】  视网膜神经节细胞；杞贞胶囊；中医药疗法

    Beijing Institute of Ophthalmology, Affiliated Beijing Tongren Hospital, Capital University of  Medical Sciences. Beijing China，100730

    ［Abstract］  Objective  To investigate the Chinese herb Qizhen used in capsule form as a neuroprotective agent on retinal ganglion cells in an optic nerve crush model in rats. Methods  Fifty rats were randomly and equally divided into 5 groups. The optic nerve of the right eyes was crushed by micro-clipping. Different treatment protocols were used for each of the 5 groups. The negative control group was given normal saline, the positive control group was treated with a 4.69% Yimaikang tablet, the low, middle and high dose groups were treated with 16.4 g/100 ml, 32.8 g/100 ml and 65.6 g/100 ml of Qizhen, respectively. For all of the treatments, the dosage was 4ml/kg daily. The experiment lasted for 4 weeks. Retinal ganglion cells (RGCs) were retrograde labeled 5 days before sacrifice. The retinal ganglion cells were quantitatively analyzed by computer with CPAS software. Results  The average survival percentages of retinal ganglion cells in the negative control group, positive control group, low dose, middle dose and high dose treatment groups were (40.88±12.50)%，(59.34±9.19)%，(52.66±12.52)%，(59.39±7.45)% and (63.00±8.95)%, respectively. A significant difference was found between the negative control and low dose groups(P=0.014). A highly significant difference was found between the negative control group and positive control, middle dose and high dose treatment groups（P<0.01). Conclusion  A Qizhen capsule has a neuroprotective effect on retinal ganglion cells in an optic nerve crush model in the rat. Yimaikang was also found to have a neuroprotective effect in this experiment.

    [Key words]  retinal ganglion cell;  Qizhen capsule； Chinese herbs therapy

    青光眼是一种主要的致盲性眼病，我国有青光眼患者940万，其中56%为单眼盲，19%为双眼盲[1]。以往青光眼的治疗为控制眼压，最近的研究表明，至少有1/6的青光眼患者出现视神经损害时眼压并不增高[2]。另一些患者尽管眼压得到了有效控制，但视神经病变却继续进展，表现为视野缺损和其他视功能的逐渐减低，最终导致患者失明[3]。视网膜神经节细胞的慢性进行性丢失是青光眼最主要的病理生理学特征，它与中枢神经系统损伤后的继发性损害极为相似，都是由于细胞外环境中毒性物质增加，使原发损伤以外的细胞逐步进入细胞凋亡程序，最终丢失[4，5]。因此，对抗节细胞外环境中的毒性物质，增加节细胞的存活能力成为视神经保护药物的基本条件。

    杞贞胶囊为同仁医院院内制剂，临床主要用于青光眼视神经萎缩，批件号为临06010。本研究利用大鼠视神经夹伤模型，对其视网膜神经节细胞的保护作用进行了药效学评价，为临床应用提供药理依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物  SD大鼠，SPF级，雄性，体重（250±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号：SCXK（京）2002-0003。

    1.1.2  药物  杞贞胶囊，由枸杞子、女贞子、墨旱莲等中草药按现代制剂制备工艺制成，北京临床药学研究所提供，批号：20050521，用蒸馏水分别配制成低剂量（16.4 g生药/100 ml）、中剂量（32.8 g生药/100 ml）和高剂量（65.6 g生药/100 ml）三个浓度的溶液，设为低、中、高剂量组；益脉康片，湖南湘雅制药有限公司提供，批号：0505102，用乳钵研碎，过200目筛，用蒸馏水配制成4.69%的溶液。

    1.1.3  主要试剂和仪器  戊巴比妥钠（购自上海化学试剂分装厂）；荧光金（购自美国荧光金公司，批号：20916）；甲醛溶液（国药集团化学试剂有限公司生产，批号：20040201）；手术显微镜（日本拓扑康公司，OMS-85型）；微型视神经夹（美国学者赠送，TKF-2型）；荧光显微镜（日本奥林巴司公司，AH-2型）；脑立体定位仪（美国David Kopf 仪器公司，900 型）；Mustek扫描仪（联想计算机公司）；CPAS图像分析软件（北京大衡软件公司）。

    1.2   方法

    1.2.1  分组  SD雄性大鼠50只，眼前部检查、Mydrine散瞳眼底检查无异常，按计算机调出的随机数字表分5组：分别为阴性对照组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组大鼠各10只。各组大鼠右眼为损伤眼，左眼未做视神经夹持，作为正常对照。

    1.2.2  夹伤模型及给药方法  大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠3 ml/kg进行麻醉，剪开外眦，在手术显微镜下剪开球结膜并做相应的分离，暴露视神经。用夹持力40 g的微型视神经夹在球后2 mm处夹持视神经60 s，恢复球结膜并缝合外眦伤口。夹持视神经时可见一过性眼底血管痉挛，夹伤后2 min内完全恢复。阴性对照组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组于视神经夹伤后2 h及此后每天分别用生理盐水、4.69%益脉康和低、中、高剂量的杞贞胶囊溶液灌胃给药，4 ml/kg，实验时间为28 d。

    1.2.3  逆行标记  动物安死术前5 d，采用双上丘注射法逆行标记视网膜神经节细胞[6]。2%戊巴比妥钠3ml/kg腹腔注射使动物麻醉，将其固定在脑立体定位仪上，用牙科钻钻开颅骨，用微量注射器吸取3%荧光金，每侧上丘注射两点（前囟后5.9 mm和6.4 mm，旁开1.4 mm，深4.0 mm），每点注射1.5 ?滋l。

    1.2.4  视网膜铺片  上方12点处球结膜以缝线标记，立即取出眼球固定于10%甲醛溶液中2 h。沿角膜缘后0.5 mm剪开眼球，去除角膜和晶状体，分离视网膜并将其定向平铺[7]，放空气中自然干燥。用市售无色指甲油封片。用荧光显微镜拍摄照片，距离视乳头中心2 mm上下左右各拍摄照片一张，照片放大125倍。

    1.2.5  图像分析  使用联想Mustek扫描仪将照片以100 dpi扫入计算机，使用CPAS颗粒分析软件进行节细胞计数[8]，将上下左右4张照片节细胞数量累加，并转化成节细胞密度。右眼节细胞密度与左眼节细胞密度之比定义为节细胞存活率，即节细胞存活率= 右眼节细胞密度/左眼节细胞密度×100%。

    1.2.6  统计学方法  用SPSS 10.0软件，统计分析采用非平衡组合的多因素方差分析。

    2  结果

    实验结果显示，阴性对照组节细胞平均存活率为40.88%，阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组节细胞的存活率分别为59.34%、52.66%和59.39%和63.00%。单因素方差分析表明，各组节细胞存活率差异有非常显著性（P<0.01）。两两比较结果显示，阴性对照组与低剂量组之间差异有显著性（P=0.014），与阳性对照组、中剂量组和高剂量组之间差异有非常显著性（P<0.01）。说明益脉康与三个剂量组的杞贞胶囊都能有效地保护视网膜神经节细胞。在用药组之中，低剂量组与高剂量组之间差异存在显著性（P=0.03），而中剂量组与高剂量用药组之间差异未见显著性（P=0.438），但其节细胞存活率仍然有所提高，从59.39%提高到63.00%，说明杞贞胶囊可以保护节细胞，而且随着剂量的增加，其保护作用逐渐增强。各组节细胞存活率见表1，阴性对照组和中剂量杞贞胶囊组视网膜节细胞荧光显微照片见图1、图2。

    3  讨论

    视神经夹伤模型常用于视神经保护药物的研究，本研究采用了常见的夹伤方法[9,10]，即在颞侧做球结膜切口，于球后2 mm夹持视神经。Yoles等[11]和Buys等[10]采用该方法研究视神经保护药物，但他们的模型损伤过于严重，节细胞存活率不足10%，不利于视神经保护药物的筛选。我们使用40 g微型视神经夹夹伤视神经60 s，导致节细胞平均丢失(40.88±12.5)%，模型节细胞的丢失比较稳定。夹伤时仅造成视网膜血管短时痉挛，不造成血管永久闭塞，视网膜血管均在2 min内恢复，实验中没有一只大鼠因视网膜永久性缺血而被排除在实验之外。Yoles等[12]使用120 g压力夹伤40 s，亦不造成视网膜永久性缺血。

    益脉康能明显地保护视网膜神经节细胞，与阴性对照组比较差异有非常显著性（P<0.01），此结果与以往的研究相一致[4,13]，这从另一个方面说明了该模型的稳定性和可靠性。

    杞贞胶囊能有效地保护大鼠视神经夹伤模型的视网膜神经节细胞，在低剂量时就表现出明显的保护作用，随着剂量的提高节细胞保护作用更加明显。杞贞胶囊为纯中药口服制剂，以小鼠能耐受的最大体积药量灌胃，相当于临床用量的383倍，未出现毒性反应，疗效好，毒副作用小，有望成为视神经保护新药用于临床，其保护视神经的作用机制有待进一步探讨。

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[11] Yoles E, Wheeler LA, Schwartz M. α2-Adrenoreceptor agonists are neuroprotective in a rat model of optic nerve degeneration