半导体激光对豚鼠视网膜电图的影响

作者：王双勇 良秀    作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院 眼科，湖北 武汉 430030O 【摘要】  目的 通过早期的动物实验研究，为应用半导体激光治疗弱视提供能量强度的参考范围。方法 取豚鼠90只，雌雄不限，随机分为正常对照组A，2 mW激光处理组B， 3 mW处理组C，4 mW处理组D和5 mW处理组E，每个处理组根据照射次数的不同又分为每天一次组J，每天两次组K，加对照组共9组。每组实验动物暗适应12 h后，进行处理前闪光视网膜电图（flash electroretinogram，fERG）检测。根据各组功率及照射次数的不同，用LL-300型半导体激光弱视治疗仪经瞳孔照射眼底视网膜。实验处理结束时，以同样方法再次进行fERG，对比处理前后ERG的变化。结果 与实验前相比，不同照射功率组间a波振幅变化有统计学意义（P<0.05），其中C组实验处理后a波振幅值较处理前明显升高，而D组和E组实验处理后a波振幅略有降低；b波及N1-P1波振幅改变无统计学意义(P>0.05)。结论 豚鼠视觉感受器细胞对于不同功率照射会产生不同反应，实验前后 3 mW照射组a波幅值升高，4 mW和5 mW照射组下降。视网膜其他细胞层并未产生明显的电生理变化。

【关键词】  半导体激光 膜 网膜电图

    上世纪80年代，我科曾尝试应用低功率氦氖激光治疗弱视，并取得较好效果[1]。与氦氖激光相比，半导体激光既有与其相似的光学特性，更有光电转化效能高、操作简便、适合家用等优点。但是半导体激光经瞳孔直接照射眼底视网膜，是否会对眼的屈光间质及视网膜结构造成损伤，长期的能量累计是否引起眼部结构的远期损伤，这些都尚存疑问和争议。本实验通过对豚鼠眼进行半导体激光经瞳孔照射，观察其视网膜电生理功能学改变，来推测照射后损伤变化，以期为进一步的临床观察和应用提供能量强度的参考范围。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验对象  正常豚鼠90只，体重100～   150 g，雌雄不限，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

    1.1.2  实验材料  LL-300型半导体激光弱视治疗仪（由武汉雷纳光电技术有限公司提供），发射波长635 nm，功率有2 mW、3 mW、4 mW、5 mW四种，光斑直径5 mm。PE-400型ERG/VEP电生理测试仪（由日本Tomey公司生产）。

    1.2  方法

    1.2.1  分组  根据照射功率的不同，按随机数字法将实验动物随机分组，即正常对照组A，2 mW处理组B，3 mW处理组C，4 mW处理组D和5 mW处理组E，设定每天照射一次为J，每天照射两次为Ｋ，每个处理组根据照射次数的不同又分为BJ、BK，CJ、CK，DJ、DK，EJ、EK，加对照组共9组，每组10只。

    1.2.2  闪光视网膜电图（flash electroretinogram，fERG）检测

    1.2.2.1  角膜电极的制作  取直径0.2～0.3 mm的银丝，浸入1％的84消毒液中（主要成分为次氯酸钠，通过与银离子发生离子置换，生成氯化银）24 h即可制成氯化银丝，依据豚鼠角膜大小将其做成直径约4~5 mm的角膜接触线圈。

    1.2.2.2  电极的安放  角膜接触电极置于待测眼的角膜缘，另外将不锈钢针制成参考电极及接地电极，分别插在待测眼同侧的面颊部和后腿[2]。

    1.2.2.3  每组实验动物暗适应12 h后，用1.25％的复方托品卡胺滴眼液扩瞳，2%水合氯醛腹腔注射麻醉，用自制固定架固定，0.1％丁卡因角膜表面麻醉，暗红光下安放电极。进行处理前ERG检测，记录暗视标准混合反应（Max-R），应用白色光作为刺激， 刺激频率2 Hz，刺激光强度1.5 cd·s／m2。之后在25 cd／m2背景光下经过30 min明适应，记录30 Hz时的ERG（30 Hz-Flick），同样应用白色光作为刺激，刺激频率为30 Hz，刺激光强度为1.5 cd·s／m2，记录反应时各波振幅及潜伏期。以同样方法，在实验处理结束时（30 d后），再次进行处理后fERG检测。

    1.2.3  实验处理  由内部定时装置将LL-300型半导体激光弱视治疗仪照射时间额定为3 min。用自制固定架固定豚鼠四肢，并做内、外直肌牵引线固定眼球，根据各组功率及照射次数不同，用LL-300型半导体激光弱视治疗仪经瞳孔照射眼底视网膜，光束垂直于角膜顶点部，视网膜距离光源约33 cm，每次3 min，持续30 d。每天照射一次组（J组）在早上进行操作，每天两次组（K组），分别在早上和下午进行操作。每组动物均在相同光线条件下正常喂养，其间用0.25％阿托品滴眼液扩瞳，每天1次，持续7 d。

    1.3  实验结果测定　　检测实验前后暗视标准混合反应中a波及b波潜伏期，a波及b波振幅值，对比实验前后潜伏期及振幅的改变；检测实验前后明视闪烁光30 Hz反应波振幅值，对比实验前后其振幅的改变。

    1.4  数据统计处理  以每个个体试验前后各波振幅及潜伏时的差值作为参数（即某研究对象X的参数＝a/b振幅pre-experiment－a/b振幅post-experiment），运用SPSS 13.0统计软件进行方差分析。

    2  结果

     各组fERG检测的详细指标见表1，对照组和  5 mW组的fERG图形见图1~图4。

    2.1  a波振幅值  不同功率对于实验前后a波振幅值变化的影响有统计学意义（F=3.91，P=0.01），其中C组与D组间差异有显著性（F=8.75，P=0.002），C组与E组间差异有显著性（F=4.83，P=0.025）。不同照射次数对于实验前后a波振幅值的变化影响无统计学意义（F=0.09，P=0.76）。照射功率与次数的交互效应对其影响也无统计学意义（F=0.58，P=0.63）。

    2.2  a波潜伏期  不同照射功率及次数对于实验前后a波潜伏期变化的影响无统计学意义（F=2.39，P=0.74；F=2.72，P=0.10）。照射功率与次数的交互效应对其影响也无统计学意义(F=1.07，P=0.37）。

    2.3  b波振幅值  不同照射功率及次数对于实验前后b波振幅值的变化影响无统计学意义（F=1.24，P=0.3；F=0.18，P=0.67）。两者交互效应对于b波振幅值的变化影响无统计学意义（F＝1.74，P＝0.16）。

    2.4  b波潜伏期  不同照射功率实验前后b波潜伏时的变化影响无统计学意义（F=2.32，P=0.08）。不同照射次数对于其变化影响差异有显著性（F=6.09，P=0.02），两者交互效应对于其变化影响无统计学意义（F=0.25，P=0.86）。

    2.5  N1-P1波振幅值  不同照射功率及次数对实验前后N1-P1波振幅值的变化影响无统计学意义（F=1.63，P=0.19；F=0.06，P=0.80）；两者的交互效应对于其变化无统计学意义（F=1.21，P=0.31）。

    3  讨论

     激光医学的发展加快了激光在临床诊断治疗方面的应用。激光具有诸多生物活性作用，诸如光热效应、光化学作用、压强效应和电磁场效应。弱视治疗正是利用激光的光学活性来刺激视网膜感光细胞的活化和发育，促进视觉通路的建立和完善。但由于激光具有的高亮度、高相干性的特点，使得其光能量在时间与空间上高度集中[3]，因而当其作用于生物组织，一方面产生激活调节作用，另一方面又容易造成生物体的损伤。其致生物体损伤反应受多方面因素影响[4]，诸如功率、波长、照射时间和光斑等。

    LL-300型半导体激光弱视治疗仪发射波长635 nm，功率2~5 mW，光斑直径5 mm，其光波可以经瞳孔直接作用于眼底视网膜，而较少被眼的屈光间质所吸收[5]。本实验通过观察激光照射前后豚鼠ERG各波峰时及振幅改变，来了解半导体激光照射后视网膜的电生理变化，并以此来推测视网膜细胞的损伤反应。

    Karpe等[6]曾报道不同大小瞳孔可以影响fERG振幅大小及变化速率，Mizota和Kong等也有关于实验动物体温变化对于fERG振幅的影响的报道[7-8]，国内有学者报道检测时间的昼夜变化也可以影响实验动物fERG振幅[8]。在本实验中， 通过扩瞳以减少瞳孔大小改变对于检测结果的影响，稳定室内温度来控制麻醉后实验动物的体温变化，统一在晨间检测以减少时间段不同的影响。ERG检测结果显示，处理前后各组a波潜伏期变化无统计学意义，     3 mW组处理后a波振幅以升高为主，其与4 mW组和5 mW组有明显的统计学差异。a波主要反映视感受器细胞的电生理变化[10]，这说明视感受器对不同功率产生了不同的电生理变化；处理前后各组b波幅值变化无统计学意义，而不同照射次数可以影响b波潜伏期的变化，b波主要反映视网膜Müller细胞对视网膜电生理活动的整合作用[9]；处理前后各组30 Hz-Flick反应波波幅变化无统计学意义，30 Hz-Flick波主要反映视锥细胞的电生理活动[10]。

    实验当中，所检测的ERG各波振幅及潜伏期与正常人群及国内所报道的大鼠参考值存在一定的差异[11-12]，在反复校对检测电极的电阻、调整参考电极的接触部位之后，各波未见明显的波动，排除了测量方法影响，故认为这种差异可能为种属不同所致，其确切的原因有待进一步的研究观察。

    本实验中，a波振幅变化在各组间出现较大的差异，其主要原因有：?譹?訛3 mW组a波振幅大部分升高，其可能原因为该功率范围的激光照射并未造成明显的视网膜损害，加之弱激光的刺激作用，使视觉通路神经元生理活动性提高。?譺?訛4 mW组与5 mW组a波振幅大幅降低，推测在这两组中可能存在部分视网膜感受器细胞的功能损害。另外，对实验动物视网膜我们准备进行光镜电镜观察及免疫组化检测，以期从形态学角度、分子水平进一步验证该功率范围内的激光照射是否存在损伤反应，其结果我们将及时予以报道。

【参考文献】[1] 邱良秀，张泺，赵小杭，等. 脉冲氦氖激光治疗弱视[J]. 实用眼科杂志，1993，11（1）：42-43.

[2] 张作明，顾永昊，郭群，等. 小鼠与大鼠视网膜电图和闪光视觉诱发电位记录标准化方案建议[J]. 眼科新进展，2004，24（2）：81-83.

[3] 黄卓正，李峻亨. 现代激光医学[M]. 南宁：广西科学技术出版社，1996：72-73.

[4] 朱菁. 激光医学[M]. 上海：上海科学技术出版社，2003：76-77.

[5] 高光煌. 激光辐射伤医学防护[M]. 北京：军事医学科学出版社，1998：78-79.

[6] Karpe G， Tansley K. The relationship between the change in the electroretinogram and dark adaptation curve[J]. Physiol，1948，107(3)：272-279.

[7] Mizota A， Adachi－Usami E. Effect of body temperature on electroretinogram of the mice[J]. Invest Ophths Sci，2002，43 (12)：3754-3757.

[8] Kong J， Gouras P. The effect of body temperature on the murine electroretinogram[J]. Doc Ophthalmol，2003，106(3)：239-242.

[9] 邱萍，郭守一，张作明，等. 次声作用对于大鼠视觉电生理功能的影响[J]. 第四军医大学学报，1999，20(7)：583-586.

[10] 吴乐正，吴德正. 临床视觉电生理学[M]. 北京：科学出版社，1999：16-32.

[11] 李海生，潘家普. 视觉电生理的原理与实践[M]. 上海：上海科学普及出版社，2002：142-145.

[12] 余继锋，张作明，龙潭，等. 正常ＳＤ大鼠视网膜电图随生长发育变化的特点[J]. 眼科研究，2005，23(2)：177-179.