益视汤对脾气虚证兔视网膜脱离复位后视网膜组织形态的影响

作者：张妍春，王卉芳，杨新光，朱赛林，毕春潮，李亚芙    作者单位：中国西安市科技计划资助项目（No.GG05138） (710004)中国陕西省西安市第四医院眼科；病理科；检验科；（710014）中国陕西省西安市，西安古城眼科医院

【摘要】  目的：观察中药益视汤对脾气虚证兔视网膜脱离（retinal detachment,RD）自动复位后视网膜组织结构恢复的影响。方法：将健康成年新西兰灰兔26只随机分为脾气虚型RD自动复位组（A组）、益视汤治疗组（B组）及空白对照组（C组），采用耗气破气加饥饱失常法建立脾气虚证动物模型，在显微镜下行视网膜下注射透明质酸钠术建立视网膜脱离自动复位动物模型，用光学显微镜分别观察比较术后10，20，30d视网膜组织结构的变化。结果：B组较A组兔视网膜组织结构紊乱明显改善，细胞水肿变性明显减轻。结论：益视汤能减轻脾气虚证对视网膜脱离自动复位后各层组织细胞的不良影响。

【关键词】  益视汤；脾气虚证；视网膜脱离；视网膜组织形态

Affection of the chinese herbal drug decoction of yishi on the spleenqi deficiency models reconstruction of reattached retina

　　YanChun Zhang, HuiFang Wang, XinGuang Yang, SaiLin Zhu, ChunChao Bi, YaFu Li

　　Foundation item:Science and Technology Project Xian, China (No.GG05138)

　　Department of Ophthalmology;Department of Pathology; Clinical laboratory, the Fourth Hospital of Xian, Xian 710004, Shaanxi Province, China; Xian Gucheng Eye Hospital, Xian 710014, Shaanxi Province, China

　　Abstract　　AIM: To observe the affection of the chinese herbal drug decoction of yishi on the spleenqi deficiency models  reconstruction of reattached retina.　　METHODS: Twentysix healthy pigment rabbits were randomly divided into experimental groups and control group. The spleenqi deficiency models were induced by exhausting and breaking the spleenqi with potent Chinese herbal drugs and starving and satisfying the rabbits abnormal. Then the rabbits eyes were operated to produce the model of retinal detachment by infusion of sodium hyaluronate between the neurosensory retina and the pigment epithelium. Observe the histomorphology of reattached retina after 10, 20, 30 postoperative days.　　RESULTS: There were serious pathologic changes and a slow recovery on the retinal cells of deficiency of spleenqi group. The experimental group with chinese herbal drug decoction of yishi had an obvious improvement of the serious pathologic changes.　　CONCLUSION: The chinese herbal drug decoction of yishi can relieve the negative effects on the reattached retina that the pathology of deficiency of spleenqi syndrome brings, and the curative effect has relation with administration time.　　KEYWORDS: the chinese herbal drug decoction of yishi; the pathological state of deficiency of spleenqi; retinal detachment；the histomorphology of reattached retina

　　0引言    　　前面的动物实验结果已经表明脾气虚证对视网膜脱离（retinal detachment,RD）自动复位后视网膜组织结构的重建有严重的不良影响[1]，我们在前面研究的基础上采用自组中药制剂益视汤对伴有脾气虚证的视网膜脱离自动复位实验兔进行灌胃，观察益视汤对其视网膜复位后组织重建的影响作用。

　　1材料和方法

　　1.1材料  健康成年清洁级新西兰灰兔26只，2000～2500g雌雄不限，经裂隙灯、眼底镜检查眼前节及眼底均无异常，由第四军医大学动物实验中心提供，随机分为3组，A组12只为脾气虚型RD自动复位组，B组12只为灌服益视汤组，C组为空白对照组，A，B组分别在建立RD自动复位模型手术后10，20，30d分阶段处死并摘取眼球（每组兔各阶段处死4只），C组兔在实验结束时处死取材。于实验开始后参照耗气破气加饥饱失常脾气虚证动物模型制备方式[2]按先前的方法造脾气虚动物模型，并于实验开始后22d在手术显微镜下按原方法造RD自动复位动物模型[1]。益视汤由人参、黄芪、牛膝、枸杞、茺蔚子、    　　图1  兔视网膜组织学表现（HE×40）  A：正常兔视网膜；B：A组术后10d；C：B组术后10d；D：A组术后20d；E：治疗组术后20d；F：A组术后30d；G：B组术后30d。（略）

　　当归等9味药按一定比例混合，凉水浸泡30min后煎开20min，共煎2次并混合药液，80℃恒温浓缩药液制成1kg/L浓度煎剂，4℃保存备用。中药材经陕西中医学院药用植物研究室检验合格。药量按人用量的两倍进行体表面积换算为11mL/kg，RD自动复位模型制备后Ⅳ组兔每天上午经胃管灌喂益视汤煎剂直至术后10，20，30d处死取材，其它各组同时灌喂等量生理盐水。

　　1.2方法  在造模和恢复过程中观测兔子的精神、症状、体重、肛温、食量、大便及小便情况、活动度、舌象、死亡数等。造模后用直接检眼镜于术后每天观察眼底视网膜脱离的范围、视网膜隆起的高度、裂孔大小、自动复位时间、视网膜出血情况和玻璃体反应等情况。在预定的实验期满后，采用耳缘静脉注射过量30g/L戊巴比妥钠处死实验兔，即刻摘取眼球，右眼于多聚甲醛中固定24h后沿视神经水平面切开，再沿矢状轴经视神经鼻侧2mm处切开，取鼻下方发生过RD并已复位区域的视网膜组织，经乙醇梯度脱水，氯仿透明，浸蜡包埋，用切片机连续切成厚3μm的切片5张，分别贴于载玻片上，常规脱蜡，HE染色封固。显微镜下观察并拍照。

　　2结果

　　2.1宏观指标结果  制备脾气虚证模型过程中，造模开始后7d，A，B组实验兔全面出现纳食量减少、精神萎靡、蜷缩嗜卧、拱背、受惊时无神、软便、体质量减轻、毛色枯黄等脾气虚证一般症状体征，10d后出现耳尾色白、体温升高、舌质淡嫩、少苔。停止脾气虚造模因素后观察到该组兔软便持续存在，毛色灰白、体质量减轻、精神倦怠等脾气虚证一般症状体征持续至实验结束。B组兔经治疗后脾气虚证一般症状体征逐渐得以恢复。C组兔未见明显异常。

　　2.2眼部变化  手术过程中有2眼在视网膜上造孔时发生视网膜表面少量出血平铺于视网膜前，未进入玻璃体；2眼出血量较多进入玻璃体，术后1d观察所有实验眼角膜均透明、前房清亮、晶状体透明，2眼玻璃体下方少量积血呈絮状，其余玻璃体无混浊,直接检眼镜下见下方视网膜均呈灰白色隆起4～5D,范围达50%～60%,裂孔约1～2PD大小,均位于鼻下方近赤道部。视网膜前及玻璃体积血吸收较快，3～4d完全吸收。A组兔RD维持7.5±2.2d，B组兔RD维持6.7±2.2d，经方差分析两组自动复位时间均数之差异无统计学意义。

　　2.3视网膜变化  C组光镜下清晰可见视网膜色素上皮层、视杆与视锥层、外核层、外丛状层、内核层、内丛状层、神经节细胞层、神经纤维层等正常结构，各层细胞及组织排列整齐，层次结构清晰（图1A）。术后10d A组光镜下所有眼视网膜均复位，厚度明显增加，各层均有水肿。色素上皮细胞肥大、增生、游离，色素颗粒减少。光感受器外节结构显著紊乱、断裂缺失，内节疏松水肿，空泡变性。各层细胞均可见细胞肿胀、空泡变性，尤以双极细胞层和节细胞层明显。内、外核层细胞可见明显核固缩，外核层更严重。内外网状层结构紊乱，疏松水肿，Müller细胞框架纤维结构紊乱，神经纤维层空泡，部分神经节细胞水肿（图1B）。B组视网膜复位，色素上皮细胞未见明显增生及游离，外节及内节结构紊乱、内外核层及节细胞水肿较A组轻。视细胞内节、内核层及内丛状层空泡变性减轻，内外核层均可见核固缩现象，Müller细胞纤维支架结构局部紊乱，神经纤维层空泡及部分节细胞水肿（图1C）。术后20d：A组视网膜各层水肿较A组术后10d减轻，RPE层色素颗粒增多，个别细胞游离。光感受器结构紊乱明显，外节仍有断裂缺失，结构模糊，内节大量空泡样变性形成空洞。内外核层、网状层排列结构紊乱，尤以内核层为著，仍有较多细胞水肿、空泡样变性，核固缩较术后10d减少。神经节细胞水肿、神经纤维层空泡变性减轻（图1D）。 B组：视网膜各层结构基本清晰，RPE层正常外观，未见明显色素细胞游离。光感受器外节形态接近正常，少量空泡变性，内节结构仍有紊乱。内外核层、网状层结构仍有紊乱，细胞稍有水肿，部分细胞空泡变性，内外核层可见少量细胞核固缩。神经节细胞和神经纤维层结构基本正常，少量节细胞轻度水肿（图1E）。术后30d：A组视网膜光感受器结构疏松紊乱较前好转，内外核层、网状层仍结构紊乱，外丛状层囊样变性明显，双极细胞、神经节细胞水肿、空泡变性明显，内核层细胞肿胀减轻。Müller细胞纤维支架结构不清（图1F）。B组视网膜各层结构清晰，排列基本整齐。双极细胞、神经节细胞水肿轻微，个别细胞有空泡样变性。外丛状层囊样变性较A组好转。Müller细胞纤维支架结构清晰（图1G）。

　　3讨论    　　视网膜脱离（retinal detachment,RD）是一种常见的眼科疾病，也是严重的致盲性眼病，随着复位手术方法的不断改进，复位率日趋增高，但即使视网膜复位手术成功，RD仍从两个不同的方面影响视力，复位的视网膜一方面很难获得正常的视功能，另一方面它又可能成为增殖反应的核心来损伤原来并没有被涉及的视网膜(形成PVR和视网膜下增殖)。术后患者脱盲者仅占74.8%，脱残者仅占27.8%，虽经多年多数患者仍不能达到脱残水平，如何使患者术后视功能得到恢复就显得非常重要。为了促进RD术后视功能的恢复，临床除用糖皮质激素和抗生素外，多用维生素A，E等抗氧化剂，以及改善视网膜微循环促进新陈代谢的药物，但疗效并不理想。对于如何更好地促进视网膜脱离术后视功能的恢复已经引起很多专家的重视，有人在动物实验中尝试进行脑神经生长因子（BDNF）玻璃体腔内注射［3］以及高浓度氧治疗［4］对视网膜复位后视功能进行保护取得了一定的疗效。中医药作为视网膜脱离手术的辅助治疗方法在国内一直被采用，据很多文献报道经中药治疗患者术后视力有明显提高［5,6］，但这些方药的应用仅限于临床观察阶段。中医传统观念认为患者气虚不固致使视网膜不能紧贴球壁而脱落是视网膜脱离发生的一个重要病机，前期临床工作中也发现很多视网膜脱离患者伴有全身乏困、纳差、舌体胖大等脾虚湿困体征，术后给与自组中药益视汤帮助视功能的恢复取得较好疗效。我们注意到脾气虚证这一全身病理因素对视网膜脱离复位后视网膜组织结构重建可能造成的影响，通过实验在视网膜脱离加脾气虚证的病证结合动物模型上观察自组中药方剂益视汤对伴有脾气虚证的实验兔自动复位后视网膜组织细胞结构重建的影响，使中药研究更切合临床实际。    　　益视汤是在前人用药的基础上自行组方配制的中药汤剂。全方共有9味药物组成，以具有补气固脱作用的人参、黄芪作为君药，以补肝肾、养阴血的枸杞等作为臣药，以牛膝、当归等活血利水药作为佐药，以茺蔚子作为使药直达目系，全方共奏补气养阴兼活血利水的作用。实验结果表明，益视汤治疗组RD自动复位后视网膜各层组织细胞结构的恢复比脾气虚组好，能够减轻视网膜各层空泡样变性，促进外节的再生，减轻内外核层细胞及神经节细胞的变性和死亡，且其治疗作用与用药时间有关,实验结果显示用药30d治疗作用显著优于用药10d。脾气虚证可使细胞内ATP合成不足[7]，并加重机体的脂质过氧化损伤，导致机体细胞免疫和体液免疫下降，细胞及线粒体微量元素Zn，Cu含量变化，第二信使cAmp，cGmp，Ca2+含量发生改变以及基因表达异常[8，9]，推测这些均可能是RD复位后视网膜恢复受到不良影响的原因，现代药理研究表明，人参皂甙Rg1具有清除自由基、抗氧化作用［10］，人参、五味子等药物对阻止神经细胞凋亡、促进神经细胞生长有一定的作用[11]，牛膝﹑当归等具有明显的促神经生长作用［12］。具体作用机制还有待进一步研究证实。

【参考文献】  　1张妍春，毕春潮，杨新光,等.脾气虚型兔视网膜脱离复位后视细胞超微结构改变的实验研究.中国中医眼科杂志 2009：19（2）：6366

　　2陈小野.实用中医证侯动物模型学.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社 1993:184189

　　3 Lewis GP, Linberg KA, Geller SF, et al. Effects of the neurotrophin brainderived neurotrophic factor in an experimental model of retinal detachment. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999;40(7):15301544

　　4 Mervin K, Valter K, Maslim J, et al. Limiting photoreceptor death and deconstruction during experimental retinal detachment: the value of oxygen supplementation. Am J Ophthalmol 1999;128(2):155164

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　　6张仁俊.视网膜脱离手术配合中药的疗效分析.中国中医眼科杂志2000；10(3)：164165

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　　10 Chu GX, Chen X. Antilipid peroxidation and protection of ginsenosides against cerebral ischemiareperfusion injuries in rats. Zhongguo Yao Li Xue Bao 1990;11(2):119123

　　11何丽云,孙塑伦,范吉平,等.参麦注射液对神经细胞凋亡及胞浆钙变化的影响.中国中西医结合杂志2001；21（8）：605607

　　12孟凡迅，张佩云.神经细胞培养法观察单味中药促神经生长的研究.南通医学院学报 1999：19(1)：1415